腸結(jié)核與克羅恩病腸粘膜組織中膠原纖維及相關(guān)蛋白表達(dá)研究.pdf

1、腸結(jié)核（intestinal tuberculosis，ITB）是由結(jié)核分支桿菌感染引起的腸道特異性感染性疾病，是最常見的肺外結(jié)核之一，主要因感染人型結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起，少數(shù)因進(jìn)食未經(jīng)消毒的乳制品或牛奶而感染牛型結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium bovis）引起;克羅恩病(crohn's disease，CD)是一種病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發(fā)生可能是遺傳與

2、環(huán)境共同作用的結(jié)果，可以累及從口腔至肛門整個消化道任何部位。腸結(jié)核與克羅恩病是兩種病因完全不同的疾病，但均可導(dǎo)致腸道慢性肉芽腫性改變，兩病在臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡特點，組織病理學(xué)特征等方面十分相似。由于病因、治療方案及預(yù)后截然不同，當(dāng)兩病發(fā)生誤診時將會導(dǎo)致嚴(yán)重后果[5,6]。當(dāng)腸結(jié)核被誤診為克羅恩病時使用免疫抑制劑治療將引起結(jié)核擴(kuò)散，甚至危及患者生命;而當(dāng)克羅恩病被誤診為腸結(jié)核時使患者承受不必要的抗結(jié)核治療藥物的毒副作用，同時延誤原發(fā)病的治療可

3、能引起原可以避免的并發(fā)癥發(fā)生。因此，準(zhǔn)確鑒別腸結(jié)核與克羅恩病十分必要。
　　正常情況下，組織損傷后有再生和纖維性修復(fù)兩種方式，兩種過程保持動態(tài)平衡，維持著腸道正常的結(jié)構(gòu)和功能。腸結(jié)核與克羅恩病均引起腸道長期慢性炎癥，目前推測，腸道長期慢性炎癥刺激導(dǎo)致腸道組織損傷，釋放大量炎性介質(zhì)，刺激成纖維細(xì)胞等活化并在損傷部位聚集，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)合成增多，降解減少，過量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積可導(dǎo)致腸道纖維

4、化的形成[7，8]。因此，腸道纖維化在腸結(jié)核與克羅恩病中均起著重要作用。
　　在眾多參與纖維化形成的蛋白中，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是目前公認(rèn)的最重要的致纖維化細(xì)胞因子，在腸道纖維化過程中起重要作用[9,10]。在克羅恩病狹窄腸段中TGF-β表達(dá)明顯增高，并與成人克羅恩病引起早期腸道切除術(shù)相關(guān)[11]。目前有不少研究探討克羅恩病中腸道纖維化形成的機(jī)制。相關(guān)研究提示克羅恩病相關(guān)的腸道纖維化可能與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial

5、-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(如波形蛋白，vimentin)表達(dá)增加[12,13]。
　　因此，本研究擬通過比較腸結(jié)核與克羅恩病腸鏡活檢粘膜組織中總膠原纖維、Ⅰ型、Ⅲ型膠原沉積量及纖維化相關(guān)蛋白TGF-β、vimentin表達(dá)差異，探索這些指標(biāo)在鑒別腸結(jié)核與克羅恩病中的價值，尋找鑒別兩病的新方法。
　　目的：
　　通過分析腸結(jié)核與克羅恩病患者

6、腸鏡活檢標(biāo)本膠原纖維及纖維化相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)在兩者間表達(dá)水平差異，探索其在鑒別兩病中的價值，尋找鑒別兩種疾病的新方法。
　　方法：
　　收集2006年1月至2015年6月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院確診為腸結(jié)核、克羅恩病患者的腸鏡活檢標(biāo)本，同時收集健康體檢者的回盲部組織作為正常對照組，其中腸結(jié)核組15例，克羅恩病組19例，正常對照組15例。每例病理組織連續(xù)切片4張，分別行masso

7、n染色、免疫熒光雙染色、免疫組化染色。采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus6.0)分析圖片，計算累積吸光度(Integral opticaldensity，IOD)，以IOD反應(yīng)各指標(biāo)表達(dá)水平，比較各指標(biāo)在三組間表達(dá)差異，并采用受試者工作曲線（Receiver Operator Curve，ROC曲線）評價這些指標(biāo)對鑒別兩病的價值。所得數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0軟件分析，P小于0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：

8、
　　腸結(jié)核組、克羅恩病組臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡下及病理學(xué)特征比較腸結(jié)核組與克羅恩病組臨床表現(xiàn)及并發(fā)癥比較:在臨床表現(xiàn)方面，腹痛、腹瀉、體重下降在克羅恩病組較腸結(jié)核組多見，而發(fā)熱、血便在腸結(jié)核組較克羅恩病組多見，但這些癥狀在兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）;腸結(jié)核組合并腸外結(jié)核較克羅恩病組多，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.028)，克羅恩病組合并腸腔狹窄、腸梗阻、瘺管形成均較腸結(jié)核多，但兩者比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞

9、0.05）。腸結(jié)核組與克羅恩病組內(nèi)鏡下表現(xiàn)及病理組織學(xué)特征比較:在內(nèi)鏡下表現(xiàn)方面，假性息肉及鵝卵石征在克羅恩病中更常見，顯著高于腸結(jié)核組(P＜0.05)，腸粘膜充血、糜爛、潰瘍形成、縱行潰瘍及粘膜橋形成在克羅恩病組中較腸結(jié)核組中多見，而回盲瓣受累、環(huán)形潰瘍在腸結(jié)核組中較克羅恩病組中更常見，但這些指標(biāo)在兩病間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）。
　　Masson染色檢測總膠原纖維在各組間表達(dá)通過masson染色法觀察膠原纖維在各

10、組間表達(dá)，在Masson染色中，膠原纖維呈藍(lán)色信號。正常腸道組織中可觀察到少量膠原纖維均勻分布于腸道各層中，腸結(jié)核組及克羅恩病組膠原纖維表達(dá)顯著增高，交錯排列于腸道各層中。各組間膠原纖維含量比較:(1)三組間總膠原纖維含量（正常組:6964.20±819.98;腸結(jié)核組:22093.53±1643.12;克羅恩病組:15200.42±1232.63）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(2)組間比較:a.在腸結(jié)核組與克羅恩病組中，纖

11、維沉積量顯著增高，總膠原纖維定量均顯著高于正常對照組（P正常組vs ITB組=0.000; PCD組vs正常組=0.000）;b.腸結(jié)核組與克羅恩病組比較，腸結(jié)核組總膠原沉積量顯著高于克羅恩病組(P=0.007);表明腸結(jié)核與克羅恩病均可引起腸道不同程度纖維沉積，且以腸結(jié)核引起腸道纖維沉積更顯著。
　　免疫組化檢測TGF-β、vimentin在各組間表達(dá)光鏡下可見轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)陽性信號呈

12、棕黃色顆粒，TGF-β在腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，vimentin主要在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。各組間TGF-3表達(dá)強(qiáng)度比較:(1)三組中TGF-β表達(dá)強(qiáng)度在腸結(jié)核組最高（70327.80±15523.75），其次為克羅恩病組（67823.21±6302.86），正常對照組最低（21871.33±3229.77），三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(2)組間比較:a.腸結(jié)核組與克羅恩病組TGF-β表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常組(PCD組v

13、s正常組=0.000，PITB組vs正常組=0.023);b.腸結(jié)核組與克羅恩病組TGF-β表達(dá)強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.998)。各組間vimentin表達(dá)強(qiáng)度比較:(1)三組中vimentin表達(dá)強(qiáng)度在克羅恩病組最高（96885.84±7073.05），腸結(jié)核組次之（63583.40±10741.80），正常組最低（30959.80±3650.68），三組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(2)組間比較:a.腸結(jié)核

14、組與克羅恩病組vimentin表達(dá)顯著高于正常組（PCD組vs正常組=0.000，PITB組vs正常組=0.030）;b.與腸結(jié)核組比較，克羅恩病組vimentin表達(dá)顯著增高(P=0.046)。
　　ROC曲線分析各指標(biāo)對鑒別腸結(jié)核與克羅恩病的價值以上實驗結(jié)果表明，腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量、纖維化相關(guān)蛋白vimentin表達(dá)水平在腸結(jié)核組與克羅恩病組間存在統(tǒng)計學(xué)差異。通過ROC曲線評價以上四項指標(biāo)對兩種疾病

15、的鑒別診斷價值。曲線下面積（Areaunderthe curve，AUC）反映診斷實驗的準(zhǔn)確性，當(dāng)曲線下面積小于0.5時無診斷價值，曲線下面積在0.5-0.7時診斷準(zhǔn)確性較低，在0.7-0.9時診斷準(zhǔn)確性較高，在0.9以上時診斷準(zhǔn)確性最高。ROC曲線分析結(jié)果顯示，腸粘膜組織中總膠原纖維量、Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維量對腸結(jié)核與克羅恩病有一定的鑒別診斷價值。以腸結(jié)核為陽性事件，總膠原纖維定量ROC曲線下面積為0.807(P=0.002，95％CI

16、0.661-0.953)，其在截斷值為16937處診斷指數(shù)最大，對鑒別兩病的靈敏度為80.0％，特異度為78.9％，陽性預(yù)測值為75.0％，陰性預(yù)測值為83.3％;Ⅰ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.751(P=0.013，95％CI0.589-0.913)，其在截斷值為4392處診斷指數(shù)最大，對診斷兩病的靈敏度為86.7％，特異度為52.6％，陽性預(yù)測值為59.1％，陰性預(yù)測值為83.3％;Ⅲ型膠原纖維ROC曲線下面積為0.814(P=

17、0.002，95％CI0.672-0.956)，其在截斷值11771處診斷指數(shù)最大，對鑒別兩病的靈敏度為73.3％，特異度為73.7％，陽性預(yù)測值為68.8％，陰性預(yù)測值為77.8％。而vimentin表達(dá)強(qiáng)度的ROC曲線下面積為0.235(P=0.009，95％ CI0.059-0.411)，對鑒別兩病價值不大。
　　結(jié)論：
　　腸結(jié)核與克羅恩病在臨床特征、腸鏡及病理表現(xiàn)非常相似，臨床難以鑒別。兩病均可引起腸道不同程度纖維