β-防御素2與克羅恩病的相關(guān)性研究.pdf

1、背景和目的： 克羅恩病(Crohn's disease，CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一個主要類型，是一種腸道慢性透壁性炎癥性疾病(transmuralinflammation)。CD在西方國家常見，發(fā)病率約為10/萬～100/萬左右。近20年來，隨著國內(nèi)臨床醫(yī)生對CD的認識加深，以及雙氣囊小腸鏡的應(yīng)用，CD發(fā)病率在我國有逐年上升趨勢。該病病因及發(fā)病機制至今不明，臨床表現(xiàn)復(fù)雜

2、多樣，易誤診，目前尚無徹底治愈方法，常用藥物治療效果欠佳，罹患者即在手術(shù)切除病變腸段后，也可能會復(fù)發(fā)而成為終身致殘性疾病，嚴重危害人類健康。 既往對CD的研究多集中于潛在的特異性黏膜免疫功能失調(diào)，以及相關(guān)的黏膜細胞群和細胞因子在黏膜損害的病理方面，有關(guān)腸黏膜屏障保護作用在炎癥性腸病上的研究甚少。近年來，研究人員認為腸道黏膜防御素在維持黏膜平衡中發(fā)揮重要作用，防御素缺乏或誘導(dǎo)缺陷可以導(dǎo)致細菌逐漸入侵，啟動炎癥過程，降低黏膜耐受能力

3、，導(dǎo)致疾病發(fā)生，且越來越多的證據(jù)表明在黏膜屏障防御功能上CD和UC可能存在著不同。 研究表明：哺乳動物(包括人)防御素是一類陽離子多肽，包括α-防御素(HNP1-4和HD5-6)和β-防御素(HBD-1、HBD-2、HBD-3)兩個家族，基因均定位于8號染色體上，分子量為3～5kD，相距不超過100～150kb，它們享有共同的起源。其中α-防御素中HNP1-4主要分布在中性粒細胞中，稱為髓源性防御素；HD5-6主要由腸道內(nèi)潘氏細

4、胞所合成分泌，稱為腸源性防御素。β-防御素則廣泛存在于皮膚、腸道及肺臟的上皮細胞內(nèi)，是機體重要的內(nèi)源性生物防御屏障，由36～42個氨基酸殘基組成，分子內(nèi)3個二硫鍵組成特征性的β片層結(jié)構(gòu)。其表達分為結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型，HBD-1在組織中表達呈結(jié)構(gòu)型，可持續(xù)型表達，HBD-2和HBD-3主要出現(xiàn)在病灶區(qū)域，在皮膚、腸道及肺等上皮組織受到TNF-α，LI-1β刺激或直接與細菌莢膜等接觸時，成誘導(dǎo)型表達。其中，β-防御素-2(HBD-2)不但參于機

5、體的先天性免疫，而且還可刺激未成熟的樹突狀細胞和記憶性T細胞參于獲得性免疫反應(yīng)。因此，機體防御素水平將影響機體抵抗微生物入侵的能力與感染者的預(yù)后。同時，先天性免疫功能下降，導(dǎo)致機體觸發(fā)對正常腸黏膜上皮的一種異常炎癥反應(yīng)，可能會引起CD發(fā)病。近年來，研究人員認為腸道黏膜防御素在維持黏膜平衡中發(fā)揮重要作用，防御素缺乏或誘導(dǎo)缺陷可以導(dǎo)致細菌逐漸入侵，啟動炎癥過程，降低黏膜耐受能力，同時，腸道正常菌群也可能因先天性宿主防御功能的損害而參與慢性炎

6、癥過程，導(dǎo)致了CD的發(fā)病，且越來越多的證據(jù)認為黏膜防御功能的改變同CD發(fā)病相關(guān)。本研究以正常大腸黏膜組織、CD患者腸黏膜組織及UC患者腸黏膜組織為研究對象，采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)及原位雜交(in situhybridization，ISH)方法，從蛋白和mRNA水平對HBD-2進行檢測，探討HBD-2在CD發(fā)病機制中的作用及其意義；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測了TNF-α及IL-1β在正常大腸黏

7、膜、CD和UC病變黏膜的蛋白表達，以評估TNF-α及IL-1β與IBD疾病程度的相關(guān)性。 目前，國外多項研究證明CD是一種復(fù)雜的多基因疾病，遺傳因素與環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致CD的發(fā)病已逐漸被認可，因此，從基因水平上研究CD的發(fā)生發(fā)展及臨床特征，是目前研究的主流，其主要任務(wù)是闡明其發(fā)病的病因及發(fā)病機制，尋找其相關(guān)的易感基因，對這一研究的突破不僅能使我們更好地理解CD發(fā)生的病理生理機制，而且還將能指導(dǎo)我們對CD進行早期診斷、預(yù)防和治療

8、。因此，為探討HBD-2基因是否為CD發(fā)病的易感基因，用PCR-直接測序法，以廣東地區(qū)漢族人群為研究對象，采用病例對照研究的方式，對HBD-2基因啟動子區(qū)進行基因多態(tài)性的初步分析，以進一步探討HBD-2是否與CD的發(fā)病存在著相關(guān)性。 材料和方法： 1、收集南方醫(yī)院消化科及普外科確診的CD患者45例，門診健康體檢50例，空腹抽靜脈血5ml；收集其中32名CD患者腸黏膜，同時收集確診的UC患者腸黏膜35例，正常腸黏膜30例。

9、 2、將收集到的腸黏膜標本做石蠟包埋后行連續(xù)4mm切片，利用IHC和ISH方法檢測HBD-2在mRNA與蛋白水平上的表達；利用IHC方法檢測TNF-α和IL-1β在三者腸黏膜上的蛋白表達。 3、將收集的靜脈血分別提取基因組DNA后，根據(jù)所需啟動子區(qū)片段的大小設(shè)計引物，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增目的片段。將PCR產(chǎn)物純化后采用直接測序法測定全序列，并與基因庫數(shù)據(jù)對照，以發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點。 結(jié)果： 1、免疫組化及

10、原位雜交染色結(jié)果分析： 免疫組化結(jié)果顯示HBD-2蛋白水平在CD、UC和正常對照三者的腸黏膜上表達差異具有顯著性意義(P=0.000)，HBD-2在CD患者腸黏膜上的陽性表達率為43.8％，在UC患者腸黏膜上的表達率為77.1％，二者比較差異具有顯著性意義(P=0.018)。原位雜交結(jié)果同免疫組化結(jié)果一致，HBD-2在CD、UC和正常對照三者的腸黏膜mRNA水平上的表達差異有顯著性意義(P=0.000)。HBD-2在UC患者腸黏

11、膜上表達較高，表達陽性率為62.9％，CD患者腸黏膜上HBD-2的陽性表達率是34.4％，二者比較差異有顯著性意義(P=0.028)。TNFα及IL-1β在CD及UC中均為陽性表達，二者比較差異無顯著性意義(P=0.675和P=0.464)，且隨著CD和UC的病情加重表達程度也明顯增加，正常組織這兩者無或僅有弱陽性表達。 2、HBD-2啟動子區(qū)基因測序結(jié)果分析： 通過PCR-直接測序法檢測病例組及對照組進行分析比對后發(fā)現(xiàn)

12、有4例患者存在著HBD-2上游啟動子區(qū)-233(C→G)位點存在著基因多態(tài)現(xiàn)象，而50名正常對照并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。二者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)。 結(jié)論： 1、HBD-2在CD和UC患者腸黏膜上存在的表達差異，CD患者可能存在HBD表達的缺陷，HBD-2可能在CD發(fā)病機制上起了重要的作用。 2、TNF-α與IL-1β同IBD疾病的病情程度相關(guān)，將來作為病情嚴重程度評定的指標及藥物治療的依據(jù)。 3、