納米硒的體內(nèi)外生物效應研究.pdf

1、硒是人類和動物所必需的微量元素，以硒代半胱氨酸的形式位于多種硒蛋白的催化部位發(fā)揮其生理作用，但其營養(yǎng)范圍很窄，過量攝入會對生物產(chǎn)生一定的毒性。而納米硒作為一種有別于普通無機硒和有機硒的新型硒形式，因其特殊的理化特性而受到廣泛關注，但是目前關于納米硒生物學效應的研究結果各異，相關代謝作用機制仍沒有完全清楚。體外Caco-2細胞模型和模式動物斑馬魚已被廣泛用以營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和生物學效應研究。鑒于此，本文運用Caco-2細胞體外模型和蛋白組學

2、技術比較研究了納米硒相較于其它形式硒（Se-Met和Na2SeO3）在細胞中的代謝差異，運用斑馬魚模式生物進行體內(nèi)納米硒的急性毒性研究，旨在深入探究納米硒相對于普通無機硒和有機硒的獨特生物學效應及其產(chǎn)生機制，為納米硒的應用奠定一定理論基礎。主要研究結果如下:
　　1、結合粒徑分析技術，探究了制備不同粒徑納米硒的不同方法。運用多糖模板法制備得到了平均粒徑在130nm左右的納米硒粒子，運用蛋白質(zhì)模板法制備得到了平均粒徑分別在25 nm

3、、40nm和80 nm左右的納米硒粒子，后續(xù)實驗采用了蛋白質(zhì)模板法制備納米硒。
　　2、建立Caco-2細胞模型進行了三種形式硒（Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3）在模型中的轉運和攝取試驗。37℃下，相同濃度（0.1μmol/L）的三種形式硒在模型中的轉運和攝取在AP-BL和BL-AP兩個方向上都是呈現(xiàn)時間（2h內(nèi)）依賴。到2h為止，Caco-2細胞對Nano-Se和Se-Met的轉運率（分別為9.11±3.09％和7

4、.33±2.36％）要顯著高于Na2SeO3（1.84±0.64％）(P＜0.05)，而Nano-Se和Se-Met之間的差異不顯著;同時，Caco-2細胞對Nano-Se的攝取率（8.36±1.70％）顯著高于Se-Met(4.75±0.41％)和Na2SeO3(0.99±0.14％)(P＜0.05)，且Se-Met和Na2SeO3之間也是差異顯著的(P＜0.05)。在37℃下，Na2SeO3跨Caco-2細胞單層的表觀通透系數(shù)Pap

5、p(AP-BL和BL-AP)都要顯著小于其他兩種形式的硒(P＜0.05)，而Nano-Se和Se-Met之間沒有顯著差異，且所有的Papp(AP-BL)/Papp(BL-AP)(R)都處在0.99-1.06之間，沒有顯著差異。
　　3、結合雙向電泳技術和質(zhì)譜分析研究了不同形式硒(Nano-Se、Se-Met和Na2SeO3)處理前后Caco-2細胞的蛋白質(zhì)組差異，經(jīng)過PDQuest軟件分析得到了30個差異顯著的差異蛋白質(zhì)點，經(jīng)質(zhì)譜

6、分析鑒定得到了7個涉及細胞生長發(fā)育、能量代謝、抗氧化性能等方面的有生物學意義的差異蛋白，分別為磷酸丙酮異構酶(TSP isomerase)、T-復雜的蛋白質(zhì)1亞基ζ(TCPZ)、核纖層蛋白B1(Lamin-B1)、異質(zhì)核核糖核蛋白F(hnRNP F)、超氧化物歧化酶[Cu-Zn](Cu，Zn-SOD)、泛素結合酶E2K(E2K)和谷胱甘肽合成酶(GS)。按對照、亞硒酸鈉、硒代蛋氨酸和納米硒的順序，TSP isomerase、TCPZ、L

7、amin-B1、hnRNP F和Cu，Zn-SoD的表達具有不同程度的下調(diào)趨勢，而E2 K和GS的表達具有不同程度的上調(diào)趨勢，并且除E2 K外，納米硒對其它蛋白的表達調(diào)控呈現(xiàn)與硒代蛋氨酸相似的作用效果。
　　4、以硒代蛋氨酸為參比，進行了納米硒對斑馬魚胚胎的毒性研究，得到了納米硒對斑馬魚胚胎具有致畸效應，不同濃度硒溶液暴露會使斑馬魚胚胎產(chǎn)生包括體軸彎曲（AM）、心包水腫(PE)、卵黃囊水腫(YES)、游囊膨脹不全(USB)、死亡等

8、典型畸型。隨著硒濃度及作用時間的增加，納米硒和硒代蛋氨酸誘導斑馬魚死亡的胚胎數(shù)以及畸形的胚胎數(shù)都呈現(xiàn)增加趨勢，通過計算得出納米硒在96 hpf的LC50為7.18μmol/L，在120 hpf的LC50為5.68μmol/L; DL-硒代蛋氨酸在96 hpf的LC50為67.32μmol/L，在120 hpf的LC50為54.66μmol/L。此外，在120 hpf時納米硒的TC50為3.27μmol/L，而DL-硒代蛋氨酸的TC50為

9、44.22μmol/L。
　　5、選用幾種關鍵酶作為分子指標研究了不同濃度納米硒對其活力的影響。納米硒暴露下，按照0μmol/L、2μmol/L、6μmol/L的順序，斑馬魚胚胎的堿性磷酸酶(AKP)活力呈現(xiàn)下降趨勢，并且三組之間差異顯著(P＜0.05);同時，酸性磷酸酶(ACP)和Na+K+-ATPase活力也呈現(xiàn)略微的下降趨勢，但三組之間差異不顯著(P＞0.05);谷胱甘肽-S轉移酶(GST)活力是0μmol/L和2μmol/