新型VEGF-SF-CS支架材料表征及體內(nèi)外生物相容性研究.pdf

1、目的：
　　異體骨移植因為排斥反應、病毒因素和相對較高的吸收率而在骨科及頜面整形外科的應用受到了明顯的限制。科學家及醫(yī)生們致力于尋找有廣泛應用前景的傳統(tǒng)骨移植替代品，骨組織工程技術的出現(xiàn)，極大地刺激了人工骨的研制。骨組織工程目的是骨缺損修復及重建。骨組織工程最新的研究熱點是創(chuàng)造出全新的組織相容性支架材料，而這種支架將做為骨組織再生模版，用于支持負載，細胞附著和組織缺陷的修復。支架材料應該具備足夠的機械性能，以匹配和支持的骨組織本身

2、所存在的生理負荷，從而在組織愈合過程中有利的方式轉(zhuǎn)移了支持組織的負載。
　　相比于其他生物材料，絲素(SF)和殼聚糖(CS)是兩種杰出的生物聚合物，目前是骨組織工程支架材料研究的熱點。純SF支架可支持多種類型的細胞。純SF支架呈片狀結(jié)構，具有極小的孔隙(直徑約20μm)，孔隙在SF的片狀結(jié)構之間相互關聯(lián)。然而，純SF支架在于燥狀態(tài)下很脆易碎，難于處理。CS由于其較小的炎性毒性反應和良好的生物降解性能以及優(yōu)良的骨傳導耦合性，因此在做

3、為生物支架材料的候選材料中正日益受到人們的重視。然而，由于CS力學性能較差以及其高溶脹能力導致其在做為組織工程化骨的過程中極易變形。研究人員將CS與其他生物大分子聚合物共混，以謀求建立一個功能更加完善的復合性支架來改善CS的這些不足，增強了其機械性能并保持其成骨性能。CS通過與SF共混形成SF-CS支架能夠改善SF結(jié)構并能促進骨的早期愈合。SF-CS復合支架材料目前已經(jīng)在許多領域得到應用，例如醫(yī)學、藥學、組織工程和基礎科學。
　　

4、生長因子是可溶性蛋白，具有刺激細胞增殖分化的功能，可用于幫助細胞的遷徙，增加細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。生長因子利用方式一般是將其吸收入支架材料中以維持其蛋白穩(wěn)定性及控制其在支架內(nèi)的釋放。生長因子的添加策略及方式在骨再生應用方面顯示了其重要的功能及意義。VEGF可產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應，因而在骨組織愈合過程中發(fā)揮極其重要作用。先前的研究結(jié)果論證了VEGF是骨血管化的關鍵誘導因素，并且證實了VEGF能夠影響參與骨代謝的各種類型的細胞?？茖W家證實VEGF對

5、于BMSCs的增殖、遷移和存活等有著直接作用。
　　以骨修復為目的，為細胞提供生長因子釋放的最佳方案仍然是一個難題。我們首次將VEGF在SF-CS制作過程中添加進SF-CS。在以往的研究中，生長因子被添加到培養(yǎng)基中，然后將含有生長因子的培養(yǎng)液吸收進復合支架以促進生長因子在體內(nèi)外的釋放。這種方法有著明顯的缺點，即復合支架中生長因子的劑量和空間分布是不可控的，而且釋放只發(fā)生在細胞培養(yǎng)的早期，原因是由于生長因子只存在于支架的表面并未吸收

6、入支架內(nèi)部，或由于在早期釋放量過大而后期無足夠的含量。為了解決這一難題，本研究組提出一種全新的生長因子添加策略，即在SF-CS生物支架的制備階段直接添加VEGF，而非在支架的制備完成之后才將VEGF添加進生物支架，從而開發(fā)出一種全新的VEGF-SF-CS復合支架。首先確保VEGF在SF-CS支架中能到達到治療水平的釋放。VEGF-SF-CS支架對成骨細胞及BMSCs的形態(tài)、功能、分化及增殖的影響目前還沒有研究，本實驗利用體內(nèi)外相關實驗試

7、圖填補這一空白。本研究評估了VEGF-SF-CS做為一種骨組織工程支架的可行性。本實驗首次報告了利用VEGF-SF-CS修復兔下頜骨缺損模型。
　　方法：
　　1、提取、傳代及擴增人成骨細胞hFOB1.19及形態(tài)學觀察。
　　2、制備SF-CS，并進行檢測表征。
　　3、SF-CS支架復合多孔支架降解性進行分析。
　　4、hFOB1.19和含VEGF的SF-CS支架復合培養(yǎng)。研究并比較含VEGF的絲素-殼聚

8、糖支架及SF-CS三維多孔支架中hFOB1.19增殖、粘附、分化及成骨性能。
　　5、兔BMSCs的提取、培養(yǎng)及傳代并進行細胞觀察、描繪生長曲線、成骨誘導液誘導、堿性磷酸酶細胞染色、并對細胞進行礦化結(jié)節(jié)染色。
　　6、在含VEGF的SF-CS支架及SF-CS支架三維多孔支架中接種兔BMSCs，掃描電鏡觀察并比較細胞在兩種支架內(nèi)生長情況。
　　7、兔下頜骨缺損模型的制備，分別植入VEGF-SF-CS支架及SF-CS支架三

9、維多孔支架并設立對照組。
　　8、對兔下頜骨缺損模型進行成骨性檢測。
　　9、統(tǒng)計學分析。
　　結(jié)果：
　　1.SF/CS按質(zhì)量配比5∶5更符合要求:平均孔徑（220土91）μm，孔隙率為（89.5±7.5）％;吸水率為（282±4）％，溶脹率（24.5±0.5）％;壓縮強度（0.67±0.15）MPa;壓縮模量(9.08±2.73) MPa。
　　2.在VEGF-SF-CS及SF-CS中，黏附率隨時間的延

10、長而上升。掃面電鏡觀察顯示成骨細胞生長正常，在支架表面及內(nèi)部均可見。CCK-8及ALP檢測證明VEGF對人成骨細胞hFOB1.19在SF-CS支架內(nèi)的生長有明顯的促進作用。
　　3.通過12周的動物實驗，樣品組織學檢查及兔下頜骨三維CT顯示VEGF-SF-CS支架表現(xiàn)出更好的生物相容性及成骨性。此外，在SF-CS支架中添加VEGF后，將復合支架植入兔下頜骨8周后，可以看到復合支架能明顯促進新生骨的形成。
　　結(jié)論：