Stenotrophomonas maltophilias DHHJ角蛋白酶類型及Nano-Lc MS-MS解析.pdf

1、近年來，角蛋白廢棄物因其具有很高的蛋白含量而越來越得到人們的關(guān)注。對(duì)角蛋白廢棄物進(jìn)行大量的，有效的降解成為了研究的熱點(diǎn)。其中，利用微生物降解角蛋白廢棄物更是因?yàn)槠浣到鈼l件溫和，能耗低，可以大量應(yīng)用，產(chǎn)物利于純化以及對(duì)環(huán)境無污染等特點(diǎn)而受到了廣泛的關(guān)注。但是對(duì)于微生物降解角蛋白的機(jī)制目前還是世界性的難題。本論文以本課題前期試驗(yàn)分離得到的降解角蛋白的菌株嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ為研究對(duì)象，研究其降解角蛋白的降解機(jī)制，包括不同發(fā)酵培養(yǎng)基條件下

2、的酶活的變化情況以及菌體表面的形態(tài)變化情況;以及利用不同的純化手段對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行純化，進(jìn)而對(duì)純化的酶液進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析得到其肽段序列，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　將該菌分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和羽毛培養(yǎng)基中利用發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)得其胞內(nèi)酶和胞外酶的酶活。證明該菌所分泌的角蛋白酶為一種誘導(dǎo)酶。但是其也有一定的組成性表達(dá)并少量分泌到培養(yǎng)基中，這同時(shí)也證明了羽毛并不是該菌所分泌的角蛋白酶的唯一底物。
　　同時(shí)利用掃描電

3、鏡觀察該菌在上述兩種培養(yǎng)基中的表面形態(tài)的變化情況，發(fā)現(xiàn)該菌在兩種培養(yǎng)基上都能觀察到細(xì)菌表面產(chǎn)生一定的凹陷。但是，通過對(duì)比兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)中該菌表面形態(tài)的變化，羽毛培養(yǎng)基條件下該菌所產(chǎn)生的凹陷程度更明顯，數(shù)量也更多。根據(jù)這些可以推測(cè)出該菌對(duì)于角蛋白的降解機(jī)制，一方面有該菌分泌角蛋白酶到外界環(huán)境中降解角蛋白，另一方面，該菌能夠改變其細(xì)胞膜的表面形態(tài)來吸收外界降解的角蛋白小分子至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行進(jìn)一步的降解，同時(shí)，胞內(nèi)酶起到了促進(jìn)胞外酶分泌的作用。<

4、br>　　對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ進(jìn)行發(fā)酵后對(duì)其發(fā)酵液中的胞外酶進(jìn)行初步的純化研究。首先經(jīng)過鹽析，溶液中硫酸銨飽和度在0％-20％之間對(duì)角蛋白酶有較好的分離度。之后分別以CHT羥基磷灰石和DEAE離子交換為分離介質(zhì)對(duì)經(jīng)過鹽析的角蛋白酶進(jìn)行進(jìn)一步純化，發(fā)現(xiàn)DEAE離子交換介質(zhì)對(duì)于角蛋白酶的初步分離具有更好的效果，之后將經(jīng)過DEAE離子交換純化過的角蛋白酶溶液通過G-50葡聚糖凝膠，表明G-50葡聚糖凝膠不能再次分離角蛋白酶和其他的雜蛋白

5、，所以本研究將純化條件限定為鹽析純化和DEAE離子交換純化。
　　將經(jīng)過DEAE柱層析純化過的角蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析，分析報(bào)告表明，該角蛋白酶中可能含有一個(gè)大多數(shù)水解酶都具有的功能結(jié)構(gòu)域—α/β折疊水解結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能在角蛋白酶降解角蛋白過程中起到關(guān)鍵的作用。α/β折疊水解結(jié)構(gòu)域分子量大約為31kDa，其與SDS-PAGE中所得的蛋白條帶存在一定的差異，這可能是因?yàn)榻堑鞍酌冈诩兓^程中會(huì)產(chǎn)生一定的降解，SDS-PAGE中2