功能化多肽量子點(diǎn)的制備及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、研究背景:半導(dǎo)體納米晶體，也被稱為量子點(diǎn)，具有獨(dú)特的光學(xué)、電子特性。因此，被廣泛應(yīng)用于發(fā)光設(shè)備、激光器、太陽能電池、生物標(biāo)記和生物成像領(lǐng)域。量子點(diǎn)作為一種半導(dǎo)體納米晶體與有機(jī)染料相比，具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):比如可以通過調(diào)控粒徑的大小來改變熒光發(fā)射波長，量子點(diǎn)可調(diào)節(jié)的波長范圍從400nm-2000nm，覆蓋范圍很廣，從紫外到近紅外區(qū)域;有寬的的激發(fā)光譜和窄且對(duì)稱的發(fā)射光譜;量子點(diǎn)的吸收光譜寬并且連續(xù)，同一波長的光可以同時(shí)激發(fā)不同尺寸的量子點(diǎn)而

2、發(fā)出不同顏色的光，因此能夠?qū)崿F(xiàn)一元激發(fā)，多元發(fā)射，在生物成像領(lǐng)域適用于多色標(biāo)記;很高的熒光量子產(chǎn)率，量子點(diǎn)的摩爾吸光系數(shù)高達(dá)106 L/(mol·cm)，因而可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào);良好的耐光性和耐光漂白性;量子點(diǎn)的斯托克斯位移比較大，熒光壽命比較長(20-50ns)，使得信號(hào)能夠顯著的把背景和其它熒光基團(tuán)區(qū)分開來，所以可應(yīng)用在時(shí)間分辨光學(xué)成像等。這些使他們成為理想的生物標(biāo)記和生物成像的材料。
　　 雖然通過三辛基膦-氧化三辛基

3、膦(TOP-TOPO)的有機(jī)相合成方法制備的高熒光的Ⅱ-Ⅵ族半導(dǎo)體量子點(diǎn)方法已經(jīng)很成熟了，但在生物應(yīng)用上，這些疏水性的量子點(diǎn)需要通過雙官能團(tuán)的巰基配體、二氧化硅和聚合物等修飾劑進(jìn)一步修飾使它們具有親水性和生物相容性。不足的是，這些額外復(fù)雜的修飾過程，導(dǎo)致量子點(diǎn)的粒徑變大并且熒光量子產(chǎn)率也降低很多，這是不利于在生物中應(yīng)用的。為了克服這些缺陷，近年來，發(fā)展了以巰基為表面修飾試劑的水相合成量子點(diǎn)的方法。經(jīng)過大量的努力，已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展并且

4、量子點(diǎn)的質(zhì)量可以比得上用有機(jī)金屬合成的方法制備的量子點(diǎn)。CdTe量子點(diǎn)是一類研究最廣泛的量子點(diǎn)，已經(jīng)被深入的研究和表征，具有不同粒徑大小的碲化鎘量子點(diǎn)由于強(qiáng)大的量子限制效應(yīng)，它的熒光幾乎可以覆蓋整個(gè)可見光譜范圍。CdTe量子點(diǎn)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，從電子設(shè)備到傳感器，盡管如此，但是它們的生物應(yīng)用仍然是受限制的。這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诨罴?xì)胞實(shí)驗(yàn)中會(huì)從巰基修飾的碲化鎘量子點(diǎn)釋放出有毒Cd2+離子而引起細(xì)胞毒性。近紅外量子點(diǎn)對(duì)體內(nèi)成像不僅需要很好

5、的光學(xué)性能，并且應(yīng)具有很小的粒徑和減少有毒的元素，如Cd、Pb和Hg等。然而，制備小粒徑和低毒的近紅外量子點(diǎn)應(yīng)用在生物影像上仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此有必要發(fā)現(xiàn)一種新的、可溶于水的、高熒光強(qiáng)度、低鎘或無鎘的量子點(diǎn)，具有小的粒徑和較低的細(xì)胞毒性，從而實(shí)現(xiàn)它們?cè)谏飳W(xué)中廣泛的應(yīng)用。
　　 本課題主要研究在水相中合成量子點(diǎn)，通過改變反應(yīng)條件來對(duì)優(yōu)化量子點(diǎn)的合成，從而找到最佳的實(shí)驗(yàn)條件。進(jìn)而一步合成功能化的多肽量子點(diǎn)，這種多肽功能化的量子點(diǎn)可以

6、直接應(yīng)用在生物標(biāo)記、生物傳感和生物成像上，合成方法簡單，易操作，實(shí)驗(yàn)安全性高，試驗(yàn)中選擇了四種不同的多肽以證明水相一步合成方法的通用性。通過比較不同反應(yīng)條件下量子點(diǎn)吸收和發(fā)射、量子點(diǎn)的熒光及膠體穩(wěn)定性、在不同pH、不同鹽離子濃度中的穩(wěn)定性、細(xì)胞成像和細(xì)胞毒性等試驗(yàn)來考察所合成的量子點(diǎn)。除了鎘系的量子點(diǎn)，我們也對(duì)綠色無毒的Zn和Ag系量子點(diǎn)進(jìn)行了研究，并比較了新型的量子點(diǎn)與傳統(tǒng)量子點(diǎn)在對(duì)細(xì)胞活性上的影響，在進(jìn)一步擴(kuò)大量子點(diǎn)在生物學(xué)上的應(yīng)用

7、范圍打下了基礎(chǔ)。
　　 第一部分:CdTe量子點(diǎn)的水相制備及其性能研究
　　 本部分主要研究CdTe量子點(diǎn)的水相制備，在水相中一步合成了尺寸較均一，分散性良好的CdTe量子點(diǎn)。分別采用α-硫代甘油、巰基乙酸、巰基丙酸、L-半胱氨酸和乙酰半胱氨酸作為表面修飾劑，在水溶液中直接合成了CdTe量子點(diǎn)，通過優(yōu)化反應(yīng)條件如反應(yīng)時(shí)間、不同表面修飾劑和Cd、Te比例等，單因素考察了CdTe量子點(diǎn)光學(xué)性能的變化規(guī)律。通過紫外吸收、熒光發(fā)

8、射、熒光量子產(chǎn)率和半峰寬等光學(xué)性能的比較，我們發(fā)現(xiàn)α-硫代甘油做表面修飾劑時(shí)合成CdTe量子點(diǎn)的成核及生長速度最慢，巰基乙酸做表面修飾劑時(shí)合成CdTe量子點(diǎn)的成核及生長速度最快，還可以看出以α-硫代甘油做表面修飾劑時(shí)，合成的CdTe量子點(diǎn)半峰寬較窄，說明量子點(diǎn)的分散性較好;以乙酰半胱氨酸做表面修飾劑時(shí)，合成的CdTe量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率較高;改變Cd、Te比例的試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Cd、Te比例為1∶1.23時(shí)，生成的量子點(diǎn)半峰寬比較窄，量子產(chǎn)

9、率比較高;并且經(jīng)共聚焦顯微細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了α-硫代甘油做表面修飾劑時(shí)特異性吸附最小。
　　 第二部分:一步合成功能化的多肽量子點(diǎn)及其在生物學(xué)上的應(yīng)用
　　 本部分在第一部分的基礎(chǔ)上，根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)條件來進(jìn)行試驗(yàn)。主要是介紹了一步合成功能化的多肽量子點(diǎn)。具體步驟如下:(1)以碲粉作為碲源，把0.040g碲粉和0.025g硼氫化鈉加入離心管中，加入1ml超純水，室溫放置過夜，制得碲(Te)的前體溶液;(2)以氯化鎘為鎘源，

10、在室溫條件下，把稱好的氯化鎘0.0145g加入到50ml的超純水中，攪拌至完全溶解，再加入12μlα-硫代甘油，混勻，用0.1M氫氧化鈉逐滴加入調(diào)pH至11.0，制得鎘(Cd)前體溶液;(3)取1ml鎘的前體溶液，加入10μl碲的前體溶液和含有多肽的溶液(1mg/ml)，慢慢加熱到100℃，反應(yīng)1h停止加熱，冷卻至室溫，即合成CdTe多肽量子點(diǎn);合成CdHgTe量子點(diǎn)，只需要把不同比例的氯化鎘和氯化汞混合溶液替代上述氯化鎘溶液即可。硫代

11、甘油和特定序列的多肽作為聯(lián)合配體來穩(wěn)定量子點(diǎn)，硫代甘油的羥基基團(tuán)可以使量子點(diǎn)與細(xì)胞的非特異性吸附最小，多肽主要由三部分組成:一個(gè)組氨酸(His6)尾部，它可以超過同等的金屬親和力優(yōu)先與量子點(diǎn)的表面結(jié)合;一個(gè)四聚體的聚乙二醇，它被引入作為間隔物，以減少非特異性的相互作用和改善溶解性;一種官能團(tuán)或?qū)ι镉杏H和力的肽序列，它可連接在聚乙二醇的末端。多肽功能化的量子點(diǎn)在生物傳感檢測、生物標(biāo)記和生物醫(yī)學(xué)成像都有很好的應(yīng)用前景。研究過程中用紫外/可

12、見光光度計(jì)、熒光光譜儀、納米粒度及電位分析儀、激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、酶標(biāo)儀等對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行表征，來考察量子點(diǎn)的吸收、發(fā)射波長、粒徑大小、電位、細(xì)胞內(nèi)成像、細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記、細(xì)胞毒性、形貌及單分散性。
　　 在本部分中我們提供了一個(gè)簡便的方法制備了具有很好的膠體穩(wěn)定性、高效的光學(xué)性能和約6nm的小粒徑的即用的多肽功能化的量子點(diǎn)，這種方法簡單并且十分可靠，沒有涉及復(fù)雜的生物共軛或另外的可能會(huì)損害量子點(diǎn)穩(wěn)定性和熒光強(qiáng)度的試劑，對(duì)以后大批

13、量生產(chǎn)、快捷和可復(fù)制的生物傳感檢測、生物標(biāo)記和生物醫(yī)學(xué)成像都有潛在的可能。
　　 第三部分:綠色無毒的量子點(diǎn)的研究
　　 Zn系和Ag系的量子點(diǎn)是近年來人們研究較多的綠色低毒的新型的量子點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)也在其他組報(bào)道的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些探索，分別合成了Ag∶ZnSe、Ag2Se和Ag2S量子點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行了表征和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的考察。生物成像中，量子點(diǎn)的理想發(fā)射波長應(yīng)該在近紅外區(qū)域以改善組織穿透深度和降低背景熒光。此外，近紅外量子

14、點(diǎn)對(duì)體內(nèi)成像不僅需要很好的光學(xué)性能，并且應(yīng)具有很小的粒徑和減少有毒的元素，如Cd、Pb和Hg等。然而，制備小粒徑和低毒的近紅外量子點(diǎn)應(yīng)用在生物影像上仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。對(duì)制備低毒性的熒光量子點(diǎn)來說，銀硫?qū)倩衔锸且粋€(gè)理想的窄能帶隙半導(dǎo)體材料，不過，小的溶度積常數(shù)(Ksp=6.3×10-50)和Ag2S快速的晶體生長的情況很難得到粒徑小的Ag2S量子點(diǎn)，即使如此，最近的硫化銀量子點(diǎn)的制備已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步。
　　 在ZnSe量子點(diǎn)的基

15、礎(chǔ)上摻雜Ag+，合成了Ag∶ZnSe，考察了反應(yīng)時(shí)間、Zn2+/Ag+/∶Se2-摩爾比例和不同表面修飾劑等因素的改變對(duì)合成Ag∶ZnSe量子點(diǎn)熒光性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是改變反應(yīng)時(shí)間或Zn2+/Ag+/∶Se2-摩爾比例，Ag∶ZnSe量子點(diǎn)的發(fā)射波長幾乎都不變，改變的只是熒光強(qiáng)度，經(jīng)試驗(yàn)二硫代蘇糖醇(DTT)、α-硫辛酸(DHLA)作為修飾劑時(shí)，合成的量子點(diǎn)有沉淀，且無熒光;α-硫代甘油反應(yīng)時(shí)間較長，且熒光強(qiáng)度較弱，谷胱甘肽作為表

16、面修飾劑較為理想。
　　 合成的Ag2Se量子點(diǎn)在用熒光光譜儀檢測時(shí)無熒光，故暫不能在生物學(xué)中應(yīng)用。
　　 通過改變反應(yīng)時(shí)間或硝酸銀和表面修飾劑巰基丙酸(MPA)的比例，來考察Ag2S量子點(diǎn)熒光性能的變化。實(shí)驗(yàn)證明，硝酸銀與巰基丙酸(MPA)的比例為1∶12時(shí)波長調(diào)節(jié)范圍比較大，且熒光強(qiáng)度較強(qiáng);反應(yīng)時(shí)間在7分鐘時(shí)Ag2S量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率最大，故上述比例和時(shí)間是合成Ag2S量子點(diǎn)的較優(yōu)條件。通過細(xì)胞毒性試驗(yàn)，比較Ag2S和