藍(lán)白斑篩選技術(shù)的改進(jìn)及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用.pdf

1、目的:探討藍(lán)白斑篩選技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)方面的新應(yīng)用:(1) TALENs(transcription activator-like effector nucleases)活性檢測(cè)和脫靶效應(yīng)評(píng)估;(2)檢測(cè)EGFR基因外顯子19堿基缺失突變新方法。
　　方法:設(shè)計(jì)合成一系列片段長(zhǎng)度小于150bp的插入片段,將插入片段與兩種T/A克隆載體(pGEM-T Easy vector和 pTrueBlue vector,具有不同的插入位點(diǎn),分別位

2、于密碼子7和另一個(gè)是密碼子11和36之間)連接,進(jìn)行分子克隆,進(jìn)一步觀察菌落顏色并通過測(cè)序驗(yàn)證;人工構(gòu)建基于藍(lán)白斑篩選的含有TALENs靶序列的報(bào)告質(zhì)粒,進(jìn)一步提出一種原核水平檢測(cè)TALENs有效性方法的可能性;設(shè)計(jì)一組特異性PCR引物,以樣本DNA(如人工構(gòu)建的EGFR野生型、突變型質(zhì)粒、腫瘤組織DNA、血中游離DNA等)為模板進(jìn)行PCR,進(jìn)一步進(jìn)行分子克隆。結(jié)合藍(lán)白斑篩選,人為改變閱讀框架,致使野生型閱讀框架中含有終止密碼子TAA,

3、缺失突變型因丟失一段核酸片段而不含有終止密碼子TAA,從而通過觀察菌落的顏色來確定樣品有無EGFR基因外顯子19的堿基缺失突變。
　　結(jié)論:基于兩種不同插入位點(diǎn)的TA克隆載體(pGEM-T Easy vector和pTrueBlue vector),若插入片段若是3的整數(shù)倍則菌落呈藍(lán)色;若是3的非整數(shù)倍則菌落呈白色。因此,理論上插入或缺失突變?nèi)魧?dǎo)致LacZ閱讀框移碼則呈現(xiàn)菌落藍(lán)色變?yōu)榘咨默F(xiàn)象。成功構(gòu)建2種含有TALENs靶序列的

4、報(bào)告質(zhì)粒,2種質(zhì)粒的LacZ閱讀框分別為移碼與非移碼,對(duì)應(yīng)菌落顏色為白色、藍(lán)色;在此基礎(chǔ)上提出一種檢測(cè)TALENs有效性的方法,即當(dāng)TALENs特異性剪切藍(lán)白斑篩選載體上的靶序列時(shí),導(dǎo)致多肽閱讀框的非移碼與移碼變換,從而共轉(zhuǎn)化后菌落顏色改變。該體系還可廣泛應(yīng)用于鋅指蛋白核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs),CRISPR-cas系統(tǒng)(CRISPR–Cas systems)有效性檢測(cè)。分別以人工構(gòu)建的EGFR野生型