感受態(tài)制備、藍白斑篩選

1、感受態(tài)細胞的制備 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌及初步篩選,復習：基因克隆示意圖,基因克隆操作過程：,基因工程,一、感受態(tài)細胞及重組體轉(zhuǎn)化,重組體轉(zhuǎn)入受體菌,轉(zhuǎn)化（transformation）轉(zhuǎn)染（transfection）轉(zhuǎn)導（transduction）,,轉(zhuǎn)化是將含有目的基因的質(zhì)粒導入細菌內(nèi)進行表達。 轉(zhuǎn)染是將含有真核生物基因的噬菌體感染細胞; 轉(zhuǎn)導則是指病毒從被感染的細胞(供體)釋放出來，再

2、次感染另一細胞(受體時)，發(fā)生供體細胞與受體 細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。,重組DNA分子導入受體細胞的手段,轉(zhuǎn)化方法,CaCl2誘導轉(zhuǎn)化 電穿孔 PEG介導轉(zhuǎn)化 人工體外包裝,,,特殊處理,受體細胞,細胞膜特性改變,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,感受態(tài)(competent)：宿主細胞處于容易吸收外源性DNA的狀態(tài)，處于感受態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞. 正常細胞都有

3、細胞膜（細菌還有細胞壁）作屏障，對外源分子選擇性接受。在實驗中通過一定的理化條件使細胞通透性增大，處于感受態(tài)。,制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化的常用方法 CaCl2轉(zhuǎn)化程序法：傳統(tǒng)方法,轉(zhuǎn)化效率能達到5?106－2?107轉(zhuǎn)化子/?g質(zhì)粒DNA，簡單、快速、重復性好、菌株適用范圍廣。 電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體(liposome)法、胞核的顯微注射法(microinjection)； 磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染、聚乙二醇介導的原生

4、體轉(zhuǎn)化法；,CaCl2法制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化的原理 一般受體菌對重組DNA分子的攝取能力很低，難以轉(zhuǎn)化成功。當細菌處于冰冷（0℃）0.05～0.1M的 CaCl2低滲溶液中，菌體的細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性增加，對DNA的攝取能力增強，轉(zhuǎn)化效率提高（感受態(tài)細菌）。,同時在轉(zhuǎn)化體系中的DNA形成的抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物能粘附于細菌表面，經(jīng)過42℃短時間熱休克（heat shock）處理

5、，促進感受態(tài)細胞吸收DNA復合物。在豐富培養(yǎng)基上生長1小時后，球狀細胞復原并分裂增殖，重組子中的基因在轉(zhuǎn)化細菌中得到表達，在選擇性培養(yǎng)(selective culture)平板上即可篩選出所需的轉(zhuǎn)化子。,,,,0.1mol/LCaCl2,0℃,,,,,,,,,重組體,感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化(transformation)：在分子克隆技術中，轉(zhuǎn)化特指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。 區(qū)別轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染(transfe

6、ction)與轉(zhuǎn)導(transduction),轉(zhuǎn)化與感受態(tài)細胞,二、感受態(tài)細胞制備及重組體轉(zhuǎn)化的實驗操作及注意事項,細菌轉(zhuǎn)移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min,,棄上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300μl，重懸菌體，冰浴20min,,40C，4000rpm×5min 棄上清，將管倒置于濾紙上1min，使液體流干凈 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L Ca

7、Cl2 100μl，重懸菌體。  冰浴10min,,,,冰浴10min后,,每管加入質(zhì)粒5?l,,輕輕旋轉(zhuǎn)試管，混勻混合物，在冰浴上放置20min,,試管放入420C的水浴中，放置90s，不要搖動試管,,迅速將試管轉(zhuǎn)移到冰浴，冷卻1~2min,取出試管后，每管加入LB培養(yǎng)基800?l， 置于370C搖床（100~150r/min）

8、，溫和震蕩45min 用無菌彎頭玻璃鋪菌器將200?l菌液鋪于含Amp的瓊脂平板表面 室溫放置20min，使液體被吸收（發(fā)汗） 倒置平皿，370C培養(yǎng)，12小時可見菌落生長,,,,,三、重組體的篩選,重組體克隆的篩選與鑒定,,由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法得到含有重組DNA的陽性克隆。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選的依據(jù)：

9、 基因載體的特點、受體細胞的特性和外源基因的表達。 篩選的方法： 抗藥性標志的選擇 插入表達篩選 ?-半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選（?-互補） (?-半乳糖苷酶能將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{沉淀）,(插入失活法)抗藥性標記選擇,,,,,目 錄,菌落雜交篩選法 內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR篩選重組子 Southern印跡雜交和菌落原位雜交 DNA序列分析 免疫化學檢測法,原理：基因載體上含

10、有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的基因，當外源DNA插入到載體的LacZ基因上后將造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培養(yǎng)基中的X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，結(jié)果可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌落在含有X-gal-IPTG（異丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培養(yǎng)基的顏色變化直接觀察出來。,,藍白斑實驗,α 互補的檢測,,,,,目 錄,U6,原位雜交,,,,,目 錄,Southe