實驗四、五章大腸桿菌感受態(tài)的制備、質粒dna的轉化及轉化子篩選概述

1、實驗四、五大腸桿菌感受態(tài)的制備、質粒DNA的轉化及轉化子篩選,一、實驗目的,掌握利用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)的原理；掌握質粒DNA轉化、轉化子篩選的原理；熟悉實驗的具體操作步驟，掌握無菌操作技術。,一、實驗原理,常用預冷的CaCl2處理細菌制備感受態(tài)細胞：用低溫（0℃）低滲CaCl2溶液處理快速生長的細菌，即可獲得感受態(tài)細菌。此時細菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復合物粘附在細菌表面，通過

2、熱激作用促進細胞對DNA的吸收。 在一定條件下，外源ＤＮＡ片段與感受態(tài)細胞混合、保溫和熱激，進入感受態(tài)細胞。進入感受態(tài)細胞的ＤＮＡ分子通過復制、表達，實現(xiàn)遺傳信息的轉移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉化子，即帶有異源ＤＮＡ分子的受體細胞。,二、實驗所需器材和試劑,（一）儀器設備： 恒溫搖床,電熱恒溫培養(yǎng)箱,臺式高速離心機,無菌工作臺,低溫冰箱, 恒溫水浴鍋, 制冰機, 分光光度計,

3、微量移液槍。,（二）試劑： 1.LB固體和液體培養(yǎng)基。 2.100mM CaCl2溶液。 3.待轉化質粒。,三、實驗步驟,1.挑取一DH5α單菌落于20ml LB培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng) 。,2.取其中800ul菌液于一含20mlLB培養(yǎng)液的錐形瓶，37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達到0.4-0.6之間.,3.取1.5ml菌液置于離心管內(nèi)，4℃ 10000g離心1min，去掉上清。,4℃ 10000g離心1min,4.加入1ml

4、,100mM的冰冷CaCl2溶液，反復吸打混勻，使細胞重懸，然后冰浴30min.,1ml 、100mM的冰冷CaCl2,5.4℃ 10000g離心5分鐘收集細胞，然后瞬時離心并去掉殘液；最后，加100uL、100mM的冰冷CaCl2溶液，輕輕反復吸打懸浮細胞,冰上放置3-5min,即成感受態(tài)細胞懸液。,6.感受態(tài)細胞暫且不用時加入等V30%的甘油，貯存于-70℃可保存半年，取其中一份進行轉化。,,加入等V30%甘油,7.向轉化管中加入1

5、uL質粒DNA(不超過10uL),旋轉3-5圈混合，最后于冰上放置30min。,8.將上述混合物轉移到42℃的水浴鍋中，熱休克90s(不要搖動試管)，然后將試管迅速轉移到冰浴，冷卻1-2min。,9.向管內(nèi)加入800ul的LB培養(yǎng)液。然后37℃培養(yǎng)45min-1h。,10.取適量體積的轉化細胞轉移到含有適當抗生素的LB固體平板上，用滅過菌的玻璃棒涂布均勻。室溫放置15分鐘.,11. 倒置平板于37 ℃培養(yǎng)12－16個小時。,四、實驗注意

6、事項,為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素： 1. 細胞生長狀態(tài)和密度: 細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。 3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。