大腸桿菌和農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

1、A大腸桿菌感受態(tài)的制備（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證》第38頁(yè)）1材料、設(shè)備及試劑材料、設(shè)備及試劑1.1材料大腸桿菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株1.2試劑LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10gL酵母提取物5gLNaCl10gLNaOH（1molL）1mLL400mL0.1ML預(yù)冷的CaCl2溶液（高溫高壓滅菌）50%甘油75%酒精95%酒精液氮1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備接種環(huán)、酒精燈，打火機(jī)，75%酒精

2、，95%酒精，50mL滅菌三角瓶4個(gè)，250mL滅菌的三角瓶4個(gè)，移液搶（5mL、200μL，1000μL），滅菌的槍頭（5mL、200μL，1000μL），離心管（1.5mL，50mL）恒溫?fù)u床滅菌鍋，紫外分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，制冰機(jī)，冰盒，高速冷凍離心機(jī)。2實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1、從新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌DH5α平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于5mL新鮮LB培液體養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2、培養(yǎng)12～16h，取1ml培養(yǎng)物

3、加入到100mL新鮮LB培液體養(yǎng)基中，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD=0.4~0.6(3~4h)3、在無(wú)菌條件下將菌液轉(zhuǎn)移到250mL離心管中，置于冰上10min.4、于4℃，3000rpm離心5～10min，棄上清，收集菌體。5、加入20mL預(yù)冷的0.1MLCaCl2溶液重新懸沉淀，至于冰上30min（嚴(yán)格）6、于4℃，3000rpm離心5～10min，棄上清，收集菌體。7、加入4mL0.1MLCaCl2溶液及15%(最終濃度)

4、甘油（50%的甘油1.71428mL），重懸沉淀。8、以100μL每管分裝于1.5mL凍存管中保存于液氮。3試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果4注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)CE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化1目的學(xué)習(xí)掌握CaCl2法制備感受愛的原理和方法學(xué)習(xí)掌握感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理和方法把前面實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)連接反應(yīng)結(jié)果和一種商品質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)2原理2.1名詞概念感受態(tài)細(xì)胞：處于接受外源DNA的生理狀態(tài)的細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)化：從遺傳學(xué)出發(fā)，轉(zhuǎn)化是特指以質(zhì)粒DNA或以它

5、為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并使其生物學(xué)特性發(fā)生可遺傳的變化。細(xì)胞感染：指以噬菌體、病毒作為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程，使細(xì)胞發(fā)生可遺傳的變異，它是與細(xì)胞轉(zhuǎn)化概念相對(duì)而定義的細(xì)胞致敏：用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作過(guò)程2.2原理培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coliDH5α菌在0攝氏度經(jīng)過(guò)低滲CaCl2溶液致敏處理，就可成為高效的感受態(tài)細(xì)胞，這種感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)?；靹蛑?攝氏度30min，混合物中的DNA形成DNase羥基鈣磷

6、酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，再經(jīng)42攝氏度短時(shí)熱激以促進(jìn)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，利用質(zhì)粒上的遺傳選擇標(biāo)記在LB平板上進(jìn)行初步篩選轉(zhuǎn)化菌落3材料、試劑和儀器3.1材料菌株E.coliDH5α質(zhì)粒pBS實(shí)驗(yàn)6的兩個(gè)連接反應(yīng)結(jié)果3.2試劑LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10gL酵母提取物5gLNaCl10gLNaOH（1molL）1mLL固體LB培養(yǎng)基為在液體LB培養(yǎng)基中加1%瓊脂粉LBKan(50μgmL)固體培養(yǎng)皿2個(gè)LBAmp(100μgmL)固體培養(yǎng)