利用大腸桿菌和恥垢分支桿菌表達系統(tǒng)制備結(jié)核診斷抗原的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建結(jié)核分支桿菌融合基因lhp-esat6和2×esat-6原核表達載體，分別在大腸桿菌和恥垢分支桿菌中同時誘導(dǎo)表達融合蛋白rCFP10-ESAT6和rdESAT-6純化蛋白，Western-blot分析其抗原性，并初步評估其診斷價值。 方法：以結(jié)核分支桿菌H37Rv基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增lhp和esat-6基因；用基因延伸拼接技術(shù)(SOE)將lhp和esat-6基因體外重組，構(gòu)建thp-esat6融合基因，并將

2、其克隆至pET28a和pMF41質(zhì)粒中分別構(gòu)建pET28a-lhp-esat6和pMF41-lhp-esat6原核表達載體。以DNA疫苗HG856A2為模板，經(jīng)PCR擴增2×esat6基因，并將其克隆至pET28a和pMF41質(zhì)粒中分別構(gòu)建pET28a-2xesat-6和pMF41-2×esat-6原核表達載體。將pET28a-lhp-esat6和pET28a-2×esat-6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)表

3、達融合蛋白rCFP-ESAT6(E.coll)和rdESAT-6(E.coll)。將pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化恥垢分支桿菌M.smegmatis，以乙酰胺誘導(dǎo)表達融合蛋白rCFP10-ESAT6(M.smeg)和rdESAT-6(M.smeg)。通過SDS-PAGE鑒定其表達形式，用Ni2+柱親和層析純化融合蛋白；用rESAT-6小鼠抗血清對純化的四種融合蛋白進行Western-blot分

4、析抗原性；用間接ELISA方法檢測其抗結(jié)核抗體的敏感性和特異性，并以重組蛋白刺激IFN-γ全血試驗(IGRA)評估重組抗原在結(jié)核病診斷中的價值。 結(jié)果：成功構(gòu)建了原核表達載體pET28a-lhp-esat6、pET28a-2×esat-6、pMF41-lhp-esat6和pMF41-2×esat-6。融合蛋白在兩種表達系統(tǒng)中均以包涵體形式表達；經(jīng)Ni2+柱親和純化的樣品SDS-PAGE分析純度在95％以上，并且四種融合蛋白均可與

5、rESAT-6小鼠抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接ELISA檢測結(jié)果表明：用rCFP-ESAT6純化蛋白進行結(jié)核病血清學(xué)診斷的敏感性為25％(5/20)，特異性為95.8％(23/24)；用rdESAT-6純化蛋白進行結(jié)核病血清學(xué)診斷的敏感性為30％(6/20)，特異性為95.8％(23/24)，略好于文獻報道的rESAT-6結(jié)果。 結(jié)論：本研究成功制備了結(jié)核分支桿菌的四種融合蛋白，并以此抗原建立了間接ELISA方法用于檢測結(jié)核抗體試