PM10氣動霧化法暴露后小鼠多組織毒性效應(yīng)分子標記物篩選及毒性機制研究.pdf

1、大氣污染相關(guān)疾病的發(fā)生呈逐年上升趨勢，可吸入顆粒物（PM10，空氣動力學(xué)直徑≤10μm）作為大氣污染物的主要成分，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。然而其相關(guān)毒理學(xué)資料相對匱乏，亟待進行廣泛研究。深入了解和研究PM10導(dǎo)致的有害威脅及毒性機制，對于闡明PM10的中毒機理以及其毒性預(yù)警具有指導(dǎo)作用，也對政府制定環(huán)境監(jiān)測指標及健康風(fēng)險評價具有重要意義?；诖?，本研究開創(chuàng)性地利用本課題組研發(fā)的氣動霧化給藥裝置，以小鼠為模型，結(jié)合高通量測序技術(shù)和生物信

2、息學(xué)手段，篩選對PM10毒性響應(yīng)敏感的分子標記物，并研究PM10導(dǎo)致小鼠多組織損傷的毒性效應(yīng)和機制。
　　研究結(jié)果顯示：
　　1.PM10暴露導(dǎo)致小鼠多組織病變不同年齡小鼠（幼年、成年、老年）暴露PM10一定時間（3d，7d，15d）后，HE染色觀察肺、腎臟、肝臟、心臟、大腦和睪丸組織的病理變化。結(jié)果顯示，PM10對幼年小鼠的組織損傷最為嚴重，因此，后期實驗中本研究主要利用幼年鼠為模型進行深入研究。HE結(jié)果顯示，PM10暴露

3、對肺部損傷最嚴重，腎臟、肝臟、心臟次之，對大腦和睪丸組織損傷最輕。肺部在暴露處理3d后就發(fā)現(xiàn)了炎癥細胞的浸潤，毛細血管和靜脈擴張充血，15d暴露組這些現(xiàn)象更加顯著，而且出現(xiàn)了多個病灶。腎臟組織在暴露7d后出現(xiàn)腎小球細胞增多，體積增大的現(xiàn)象。肝臟組織7和15d暴露組出現(xiàn)細胞渾濁腫脹，中央靜脈充血及炎癥細胞浸潤。心臟組織只有在15d暴露組出現(xiàn)輕微血管擴張。大腦組織和睪丸組織在暴露期間均未發(fā)生明顯病變。
　　2.PM10暴露導(dǎo)致小鼠顯著

4、的氧化應(yīng)激為了進一步確認PM10的毒性效應(yīng)，本研究依據(jù)HE染色結(jié)果提示，選擇病變明顯的肺部組織為對象，研究PM10對其造成的氧化損傷情況。研究結(jié)果顯示，不同年齡段小鼠在PM10脅迫不同時間后，肺部組織已明顯發(fā)生氧化應(yīng)激。PM10暴露3d后已經(jīng)顯著導(dǎo)致肺部組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化（MDA），其中，幼年小鼠脂質(zhì)過氧化水平最高，但是隨時間延長，脂質(zhì)過氧化水平升高不顯著。氧化損傷的另一個分子指標，GSH-Px的活性也顯著增加（P<0.05），相對來說

5、，老年組小鼠GSH-Px的活性更高。
　　3.PM10在轉(zhuǎn)錄組水平的毒性機制為了進一步深入研究PM10的毒性機制，本研究以PM10的主要毒性靶器官肺為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄組水平研究PM10的毒性機制。PM10暴露小鼠7d，發(fā)現(xiàn)了1150個差異表達的編碼基因，其中723個基因表達上調(diào)，427個表達下調(diào)，對其mRNA進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，PM10暴露后，在生物學(xué)過程上，主要影響應(yīng)激應(yīng)答、創(chuàng)傷應(yīng)答、防御應(yīng)答、炎癥響應(yīng)、免

6、疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)與應(yīng)答、化學(xué)物刺激應(yīng)答、細胞因子等生物學(xué)過程；在細胞組分上，廣泛影響細胞表面、胞外空間和基質(zhì)、溶酶體、細胞質(zhì)、細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等多種組分；分子功能上，PM10主要影響了蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鈣離子、細胞外基質(zhì)等的結(jié)合綁定能力。KEGG富集分析結(jié)果顯示，PM10主要影響了肺的吞噬體、溶酶體、補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)和抗原處理與呈遞等代謝通路。
　　4.LncRNA的表達及其靶基因富集分析在LncRNA表達研究發(fā)現(xiàn)中，預(yù)測了6571個新型L

7、ncRNA，本研究中發(fā)現(xiàn)了831個LncRNA在已有數(shù)據(jù)庫中已有注釋。PM10暴露后，共有30個LncRNA的表達發(fā)生了顯著的改變，然后通過Cis和Trans原理預(yù)測發(fā)現(xiàn)這些差異表達LncRNA共有103個靶基因。這些靶基因的GO分析顯示，PM10暴露主要影響細胞趨化、趨化因子活性與受體綁定、細胞因子活性、細胞因子受體及G蛋白偶聯(lián)受體等方面。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，PM10暴露主要影響了小鼠肺組織的細胞因子與細胞因子受體相互作用，趨化

8、因子受體，剪切體及抗原處理與呈遞等代謝通路。通過與差異表達編碼基因mRNA的富集分析比較發(fā)現(xiàn)，LncRNA靶基因的GO富集和KEGG富集有很多重疊的地方。如炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等相關(guān)過程與代謝通路。這也更加證明了PM10的毒性效應(yīng)主要涉及應(yīng)激、炎癥、免疫等方面。
　　5.結(jié)合qPCR技術(shù)篩選PM10的毒性效應(yīng)分子組學(xué)研究對于篩選毒物的效應(yīng)分子具有獨特的優(yōu)勢，本研究在測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，利用qPCR技術(shù)，在mRNA、LncRNA和cir

9、cRNA三種組分中篩選了對PM10暴露敏感的分子作為生物分子指示物。結(jié)果顯示，9個備選編碼基因可以作為PM10暴露后肺部組織的潛在分子標記物，其中Saa3、Mmp12和Kap三個基因?qū)M10暴露的響應(yīng)更加敏感，是更為優(yōu)良的生物標記分子。但對于其他組織來說，Kap和Umod基因的表達與肺組織的響應(yīng)一樣，因此其可以作為腎臟、肝臟、心臟的潛在生物標記分子。LncRNA結(jié)果顯示，肺組織暴露PM107d的結(jié)果與測序結(jié)果完全一致。H19和XLOC

10、_340807的表達顯著降低，而Gml2840、RP23-110C17.2、RP24-16A7.7和XLOC_3149476的表達顯著上調(diào)。其中RP23-110C17.2、RP24-16A7.7更適合作為肺組織對PM10響應(yīng)的標記物，尤其是早期響應(yīng)標記物。由于LncRNA的表達具有很強的時空表達特異性，因此，PM10暴露后，腎臟、肝臟、心臟中這些LncRNA對PM10暴露的響應(yīng)不同。因此，LncRNA并不適合作為通用的分子標記物指示PM

11、10毒性效應(yīng)。circRNA研究結(jié)果顯示，PM10暴露后，并沒有顯著的差異表達基因，因此circRNA并不合適用于PM10的毒性效應(yīng)指示分子。
　　6.PM10暴露導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與礦物吸收信號通路發(fā)生異常為了進一步研究PM10主要毒性效應(yīng)及機理，本研究對基于測序結(jié)果的信息分析數(shù)據(jù)進行了mRNA和蛋白表達水平的研究，對于PM10暴露影響顯著的信號通路炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與礦物吸收進行深入的研究。結(jié)果顯示

12、，PM10暴露后，四個受PM10影響顯著的信號通路關(guān)鍵分子的表達不同程度的上調(diào)。具體來說，PM10暴露后，四種組織中，炎癥反應(yīng)的標志基因CXCL1，CXCL和XCL1在mRNA和蛋白水平均呈現(xiàn)誘導(dǎo)性的上調(diào)；免疫應(yīng)答相關(guān)信號通路基因MRC1和MSR1的mRNA和蛋白表達在肺、腎兩種組織中明顯上調(diào)，另一個免疫應(yīng)答蛋白CD74的表達也呈現(xiàn)類似的表達趨勢；PM10對四種組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活情況也不盡一致，Bip和CHOP基因的蛋白表達水平在PM

13、10暴露后主要在肺、腎、肝三種組織發(fā)生明顯升高，提示這三種組織發(fā)生了明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而對心臟組織的影響較小；在轉(zhuǎn)錄水平，四種組織中Cu2+運輸相關(guān)基因SLC31A1，Ca2+結(jié)合基因S100g的表達在PM10暴露后顯著上調(diào)；Fe2+相關(guān)基因HMOX1只有在肝臟組織中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；細胞外液和電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)基因Nppa的表達則受到PM10暴露而被顯著抑制（肝臟組織中沒有檢測到該基因的表達）。在蛋白水平上，PM10暴露后，Cu2+

14、運輸相關(guān)蛋白SLC31A1和Fe2+相關(guān)蛋白HMOX1均出現(xiàn)程度不同的顯著上調(diào)，這說明PM10暴露后也會顯著影響各種礦物離子的轉(zhuǎn)運和吸收。
　　綜上所述，本研究表明：PM10經(jīng)氣動霧化法暴露后導(dǎo)致小鼠肺、腎、肝、心等多組織發(fā)生病理性損傷；誘導(dǎo)肺組織發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激，大量mRNA和LncRNA差異表達；mRNA和LncRNA靶基因的GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)PM10的毒性效應(yīng)主要涉及應(yīng)激、炎癥、免疫等方面；部分顯著差異表達的mRNA和