多氯聯(lián)苯對小鼠附睪的毒性效應(yīng)及機(jī)制的研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是最難以降解的持久性有機(jī)污染物之一。有關(guān)PCB的生殖毒性效應(yīng)及機(jī)制已開展了較多的研究，但PCB對附睪的毒性效應(yīng)及機(jī)制還不清楚。本研究以C57BL/6品系青春期雄性小鼠為研究對象，以商品化的Aroclor1254為PCB代表，研究環(huán)境水平的PCB暴露(0.5、5、50和500μg/kg)對附睪的毒性效應(yīng)及機(jī)制。
　　 青春期雄性小鼠在Aroclor1254暴露5

2、0天后，其體重、睪丸和附睪重量沒有顯著性變化，精子密度、精子活力以及頂體酶活性呈現(xiàn)劑量依賴性下降，精子畸形率呈現(xiàn)劑量依賴性上升。血清中的雌激素水平表現(xiàn)出劑量依賴性的下降，雄激素的水平?jīng)]有表現(xiàn)出顯著性的變化。Westernblot檢測的結(jié)果顯示：附睪中的雌激素受體α(Estrogenreceptorα，ERα)和雌激素受體β(Estrogenreceptorβ，ERα)并無顯著性變化，而雄激素受體在500μg/kg組表現(xiàn)出顯著性下降，提示

3、Aroclor1254對附睪表現(xiàn)出抗雄激素效應(yīng)。
　　 利用cDNA微陣列(Microarray)技術(shù)研究附睪頭部在低濃度(5μg/kg)和高濃度(500μg/kg)Aroclor1254暴露下基因的差異表達(dá)，結(jié)果顯示：共篩選出2350個差異表達(dá)基因，其中低濃度組引起附睪頭部572個基因的差異表達(dá)，包括上調(diào)基因212個，下調(diào)基因360個；高濃度組引起附睪頭部1769個基因的差異表達(dá)，其中上調(diào)基因433個，下調(diào)基因1336個。應(yīng)用

4、實時熒光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR，Real-timePCR)對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行了mRNA水平的驗證，結(jié)果證明了芯片檢測的可靠性。進(jìn)一步應(yīng)用分子注釋系統(tǒng)（MoleculeAnnotationSystem，MAS），結(jié)合功能注釋聚類(FunctionalAnnotationClustering)以及聚類分析(Clustering)等生物信息技術(shù)，對差異表達(dá)基因信息和功能以及所參與

5、的信號通路進(jìn)行挖掘和注釋，得到差異基因中最為顯著的功能類別和信號通路，其中涵蓋了GTP結(jié)合、核小體組裝、能量代謝、RNA加工等方面。為進(jìn)一步探索PCB對附睪的毒性效應(yīng)機(jī)制提供了依據(jù)。
　　 根據(jù)功能注釋聚類的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與GTP結(jié)合相關(guān)的基因在高濃度Aroclor1254暴露后表現(xiàn)出最高的富集度(Enrichmentscore)，表明相關(guān)基因的表達(dá)變化是Aroclor1254暴露作用于附睪表達(dá)譜的最顯著的效應(yīng)之一。MAS分析表明相

6、關(guān)基因的功能包括了緊密連接和肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控。Westernblot檢測表明相關(guān)的小GTP結(jié)合蛋白，如K-ras、CdeA2以及RhoA等的表達(dá)水平在PCB暴露后表現(xiàn)出顯著性的下調(diào)。小GTP結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(Myosinregulatorylightchain，MRLC)和絲切蛋白(Cofilin)的磷酸化水平來調(diào)節(jié)緊張纖維的收縮和肌動蛋白聚合的穩(wěn)定性。Westernblot結(jié)果表明MRLC磷酸化水平上升而Cofi

7、lin磷酸化水平下降，提示緊張纖維的收縮加強(qiáng)、肌動蛋白聚合的穩(wěn)定性增加。
　　 小GTP結(jié)合蛋白表達(dá)的變化和纖維的收縮加強(qiáng)提示緊密連接功能的改變。Westemblot結(jié)果表明緊密連接的組成蛋白（胞質(zhì)緊密粘連蛋白1）ZO-I在500μg/kgPCB暴露下表現(xiàn)出顯著性的下調(diào)。免疫組化結(jié)果表明定位與細(xì)胞頂端連接的ZO-1染色并沒有明顯的變化。免疫共沉淀的結(jié)果表明，Occludin的酪氨酸磷酸化的水平上升。電鏡下的硝酸鑭示蹤提示緊密連接

8、的透過性增加。緊密連接的透過性關(guān)系到精子成熟環(huán)境的維持，PCB暴露對緊密連接的影響提示了PCB對生殖毒性的新機(jī)制。
　　 對低濃度和高濃度都能夠顯著性誘導(dǎo)的差異基因進(jìn)行基因分類學(xué)注釋(GeneOntology，GO)，選取GO注釋包括細(xì)胞外空間（Extracelluarspace或Extracelluarregion）為候選標(biāo)志物。從中選取鞘脂激活蛋白原(Prosaposin，Psap)進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的驗證。將Psap表達(dá)水平