KCN慢性毒性及神經(jīng)毒性機制研究.pdf

1、第一部分，KCN慢性毒性研究
　　 目的：觀察KCN連續(xù)灌胃對Wistar大鼠的慢性毒性反應及其對各組織器官的損害程度、主要毒性靶器官及損害的可逆性，找到慢性毒性反應的有效劑量，為慢性氰化物中毒提供數(shù)據(jù)。
　　 方法：健康Wistar大鼠60只按體重隨機分為對照組、低劑量組和高劑量組三組，每組20只，雌雄各半，按0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg連續(xù)灌胃給藥14天，恢復期7天。每天測定代謝籠中動物的食量，在給藥第

2、7天、第14天、恢復期第7天測定動物的體重。在給藥第14天(d14，停藥期)和第21天(d21，恢復期)每組各1/2大鼠采血測定紅細胞計數(shù)、血紅蛋白定量、紅細胞壓積、紅細胞平均容積、紅細胞平均血紅蛋白容量、紅細胞平均血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、大未染色細胞、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間、凝血酶時間及血漿纖維蛋白原等血液學指標以及血清丙氨酸氨基轉移

3、酶、天冬氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽紅素、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶，血清鈣、磷、血清鉀、鈉和氯等血液生化指標。在給藥第14天和第21天分別對每組各1/2的動物剖檢，進行組織病理學檢查及骨髓細胞計數(shù)分類。
　　 結果：(1)給藥組大鼠在給藥后出現(xiàn)呼吸抑制、震顫等毒性反應，高劑量組較為嚴重，但均在20-30分鐘內(nèi)恢復正常。(2)連續(xù)灌胃KCN14天對大鼠的體重沒有明顯影響。

4、(3)給藥后各組動物的進食量沒有明顯變化。(4)KCN對大鼠的血液學指標沒有明顯影響。(5)KCN對大鼠的血液生化指標無明顯影響。(6)KCN給藥后，對大鼠的骨髓細胞沒有明顯影響。(7)停藥期時，高劑量組雌性大鼠腦組織的絕對重量及相對重量均顯著下降；部分高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)層小膠質(zhì)細胞灶性增生，形成膠質(zhì)小結樣病變；灰白質(zhì)交界處個別神經(jīng)元細胞變性壞死，神經(jīng)膠質(zhì)細胞灶性浸潤填充；更有個別動物大腦白質(zhì)呈灶狀空泡樣變性，伴隨有髓纖維數(shù)量的減少；

5、部分動物甚至出現(xiàn)大腦基底部白質(zhì)的灶性脫髓鞘樣改變；少量動物海馬回神經(jīng)細胞銳減，甚至出現(xiàn)局灶性海馬神經(jīng)細胞大量脫落，且脫落區(qū)域可見大量神經(jīng)膠質(zhì)細胞浸潤填充。其余臟器未見明顯異常。恢復期時未見明顯異常。
　　 結論：對大鼠連續(xù)14天的灌胃KCN試驗，給藥組大鼠在給藥時出現(xiàn)嚴重的毒性反應，毒性靶器官為中樞神經(jīng)系統(tǒng)，毒性作用可逆。
　　 第二部分KCN神經(jīng)毒性機制研究
　　 目的：結合KCN14天的灌胃試驗，對Wista

6、r大鼠大腦組織進行全基因組變化研究，找到KCN神經(jīng)毒性反應可能涉及的信號通路；并對大鼠的血液和尿液進行代謝組學分析，揭示KCN給藥對代謝產(chǎn)物的影響。
　　 方法：(1)基因組學研究：取12只大鼠(停藥期0mg/kg劑量組4只，停藥期10mg/kg劑量組4只，恢復期10mg/kg劑量組4只)的大腦組織，提取RNA，標記并擴增后與基因表達譜芯片進行雜交，經(jīng)掃描分析篩選出給藥組與對照組表達差異的基因。(2)代謝組學分析：收集對照組、低

7、劑量組和高劑量組大鼠(每組8只)給藥第14天的尿液及血清樣本，做代謝組學分析。篩選出能體現(xiàn)KCN毒性的生物標志物。
　　 結果：(1)芯片雜交信號清晰，背景低，信噪比高，基因芯片檢測和聚類分析結果有效。(2)經(jīng)過T-test檢驗，篩選出顯著上調(diào)(信號比值≥2)或顯著下調(diào)(信號比值≤0.5)的差異表達基因289個。(3)按照基因功能分類體系(GeneOntology，GO)分析差異表達基因，結果顯示，差異基因體現(xiàn)的生物學功能多樣，

8、包括正向調(diào)節(jié)成神經(jīng)細胞的增殖、大腦皮層發(fā)育、負向調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞凋亡、正向調(diào)節(jié)細胞增殖、鈣離子應答過程、動作電位的調(diào)節(jié)、細胞分化的調(diào)節(jié)等。(4)導致KCN神經(jīng)毒性的可能信號通路有：粘著斑信號通路、多巴胺能突觸信號通路、谷氨酸能突觸信號通路、細胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路、神經(jīng)受體配體相互作用信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、鈣信號通路。(5)代謝組學分析：高劑量組和低劑量組大鼠血清中磷酸膽堿，甘油磷酸膽堿，谷氨酰胺及甲基組氨酸的水平顯著升高，

9、賴氨酸的水平顯著降低。高劑量組和低劑量組大鼠尿液中氧化三甲胺，對羥基乙酸苯酯，羥丙茶堿，馬尿酸鹽，二甲胺水平相對溶媒對照組顯著增加，丁二酸，乳酸鹽，肌酸，瓜氨酸，乙酸鹽水平顯著降低。
　　 結論：(1)KCN的中樞神經(jīng)毒性作用可能和其以下特性有關：KCN神經(jīng)毒性的產(chǎn)生與神經(jīng)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，Ca2+內(nèi)流有關；KCN對粘著斑信號通路和細胞外基質(zhì)受體相互作用信號通路的ITGB6有一定的調(diào)控作用，影響細胞與細胞間的相互作用；KCN對多

10、巴胺能突觸和谷氨酸能突觸信號通路中GRIN2A有一定的調(diào)控作用，影響神經(jīng)細胞間的突觸傳遞和信號轉導；對神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路中NTRK2基因有一定的調(diào)控作用，影響神經(jīng)營養(yǎng)因子與酪氨酸激酶受體Trk的結合，進而影響神經(jīng)細胞的功能。(2)KCN神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，推測是有多條信號通路異常引起。其中最重要的機制可能是由于鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，引發(fā)Ca2+內(nèi)流，導致生物膜脂質(zhì)過氧化，影響神經(jīng)細胞的突觸傳遞和信號轉導，產(chǎn)生CNS毒性。(3)大鼠代謝組學研究結果提