代謝工程技術構建產(chǎn)均聚物聚3-巰基丙酯的Advenella mimigardefordensis菌株.pdf

1、PTE((p)oly(t)hio(e)ster)是一類人工改造的在碳骨架上含有硫的新型化合物。聚3-巰基丙酸酯(poly(3-mercaptopropionate)，PMP)是PTE聚酯的一種。和結構類似物聚羥基脂肪酸酯(PHA)相比，PTE在主鏈上將氧原子換成了硫原子。因為這種改變，該聚合物具有了一些更有價值的性質(zhì)，比如其熔點更高，溶解度更低，熱穩(wěn)定性也更高。同時另一個吸引人的性質(zhì)是其不可降解性，這些性質(zhì)讓這類聚合物有著很多潛在的用途

2、。隨著不可再生的化石能源的日益枯竭，原本來源于化石原料的聚合物都需要找到合適的替代產(chǎn)品?，F(xiàn)代化房屋建造行業(yè)，汽車制造行業(yè)以及其他許多行業(yè)都需要不可降解的聚合物材料，這是PHA這類可降解材料不能滿足的。因此開拓PTE的生物合成方法具有重要意義。
　　 PTE于1951年通過化學方法首次合成，其后又發(fā)展了多種不同的化學合成方法，但是化學方法的難制備，高成本以及低產(chǎn)率的問題制約了PTE的商業(yè)化生產(chǎn);更重要的是這些方法原料基本來源于石油

3、基，面臨著原料日益短缺及環(huán)境污染的諸多問題。使用重組有BPEC代謝途徑(由Clostridiumacetobutylicum的丁酸激酶((B)uk)和磷酸丁酰轉移酶((P)tb)以及Thiocapsapfennigii的PHA合成酶Pha(EC)組成）的大腸桿菌菌株實現(xiàn)了合成均聚物PMP。這種生物法合成的PTE材料相比較于化學法合成的材料具有單體均一并且聚合度高的優(yōu)點。但該大腸桿菌重組菌只能利用毒性較高的3MP（3-mercaptopr

4、opioante，3-巰基丙酸）為原料合成產(chǎn)物，而不能利用TDP或DTDP等低毒性原料合成PMP，這阻礙了其后期工業(yè)化應用。
　　 為了找到一株可以使用DTDP這種低毒性，低成本原料合成PMP的菌種，我們研究組進行了大規(guī)模的篩選，最終得到了若干株不同的可以降解DTDP并利用其作為唯一碳源進行生長的菌株。對其中首次鑒定的A.mimigardfordensisDPN7T進行了Tn5轉座子的突變篩選，全基因組測序和相關酶的表達與酶活測

5、定，最終發(fā)現(xiàn)和鑒定了一條完整的DTDP降解途徑。該菌對DTDP降解途徑的第一步是通過硫辛酰胺脫氫酶(dihydrolipoamidedehydrogenase，LpdA)將其催化變?yōu)?MP，而3MP又是合成PMP的一個直接前體。
　　 本研究正是利用這株菌作為構建合成PMP的基礎菌株。我們首先尋找到了可以在該菌株中穩(wěn)定自主復制的質(zhì)粒pBBR1MCS5，并嘗試著將BPEC這條唯一已知的可以合成PMP的代謝途徑構建到質(zhì)粒pBBR1M

6、CS5上得到了pBBR1MCS5(::)BPEC。但這個重組質(zhì)粒不能穩(wěn)定的在菌株A.mimigardefordensisSHX1中復制。出現(xiàn)了抑制菌體生長和質(zhì)粒傳代結構不穩(wěn)定等現(xiàn)象。通過進一步的質(zhì)粒構建和培養(yǎng)實驗，最終確定重組buk-ptb操縱子過表達是導致這些問題的根源。之后我們發(fā)展了一套適用于該菌株的，利用自殺質(zhì)粒同源雙交換原理進行基因敲除或基因替代的方法。利用此方法，將buk-ptb操縱子成功的插入A.mimigardeforde

7、nsis菌株的基因組中，得到了生長正常的菌株和穩(wěn)定遺傳的重組質(zhì)粒。并利用反轉錄PCR的方法定性的證實了buk-ptb操縱子在被插入到基因組后都可以進行轉錄。3-巰基丙酸雙加氧酶(3-mercaptopropionatedioxygenase，Mdo)是DTDP降解途徑中的第二個催化酶，該酶催化3MP生成3-亞磺酸基丙酸(3-sulfinopropionate，3SP)，因此該代謝支路會導致3MP前體底物的減少，是影響PMP產(chǎn)量的關鍵因素

8、之一。而利用mdo::Tn5突變株進行阻斷研究時，我們發(fā)現(xiàn)Tn5轉座子不穩(wěn)定，并且觀察到因轉座導致質(zhì)粒變大的現(xiàn)象。于是我們改用等位替換方法將mdo基因進行敲除，發(fā)酵結果表明敲除了mdo的菌株PMP產(chǎn)量進一步提高。本文研究同時表明A.mimigardefordesis菌株的常規(guī)碳源葡萄糖酸并不適合用于PMP合成的發(fā)酵碳源。與之相比，琥珀酸作為發(fā)酵碳源可以提高菌體量并同時提高PMP產(chǎn)量。綜合以上的工作，使用琥珀酸發(fā)酵的重組菌SHX5胞內(nèi)的P

9、MP含量可以穩(wěn)定在5％-6％。我們初步實現(xiàn)了利用DTDP合成PMP的目的。
　　 盡管如此，但該菌株的產(chǎn)量較低，并且使用的琥珀酸碳源價格昂貴。為了進一步提高PMP產(chǎn)量和降低成本，從發(fā)酵水平分別對碳源進行比較，并對發(fā)酵具體方式進行優(yōu)化以及發(fā)酵中各組分隨時間的改變進行分析。結果表明當以甘油為碳源時，細胞雖然生長緩慢，但可以積累到和以琥珀酸為碳源時相似的菌體量，并且PMP的胞內(nèi)含量幾乎提高了一倍，達到了10％，這使它成為替代琥珀酸的廉

10、價碳源。一個出乎意料的結果表明在使用甘油和丙酸的混合碳源培養(yǎng)基中(丙酸濃度設為0.2％(w/v))，丙酸作為一種‘刺激物’進一步提高了聚合物產(chǎn)量（聚合物占細胞總重量的18％左右），并提高了菌體的生長速率。但這種發(fā)酵方法使含有3MP單體的PTE中混入了少量的3HB和3HV單體（占PTE總質(zhì)量分數(shù)少于10％），并得到了一種含有三種單體的未見報道的新化合物poly（3MP-co-3HB-co-3HV）。之后對該類聚合物組成在發(fā)酵時間上的變化進

11、行了分析，最終發(fā)現(xiàn)很難通過控制發(fā)酵時間的方法將3HB和3HV單體去除。這說明這種混合碳源的發(fā)酵模式無法很好的用于PMP的生產(chǎn)。
　　 為了進一步提高PMP的產(chǎn)量，我們對之前的結果進行了總結，發(fā)現(xiàn)在使用甘油為碳源后，作為對照的不含有BPEC途徑的菌株SHX12也可以積累不顯著的PMP（胞內(nèi)含量低于2％），多次重復結果相同。這提示該菌株自身含有一條內(nèi)在的PMP途徑。通過與基因組的序列比對分析，找到了PhaEC的同工酶:由內(nèi)源的pha

12、CAm基因編碼的PHA合成酶(PhaCAm)。將phaCAm基因進行敲除，比較其對內(nèi)源PMP合成途徑和重組的BPEC代謝途徑合成PMP的影響，結果說明了三點:第一，起關鍵作用的酶是其自身的phaCAm基因編碼的PHA合成酶PhaCAm。第二，盡管phaE和phaC基因的轉錄本可以通過逆轉錄PCR被檢測到，但是異源表達的同工酶PhaEC在該菌株中沒有活性，也沒有對PMP合成有任何貢獻。第三，驗證了之前的結論，即插入基因組的buk-ptb操

13、縱子所表達的Buk和Ptb對PMP合成有比較重要的影響，顯著提高了菌株合成PMP的能力。從而最終發(fā)現(xiàn)并鑒定了編碼內(nèi)源PMP合成途徑上的PHA合成酶基因phaCAm。為了尋找更優(yōu)的PHA合成酶，我們比較了三種不同來源的phaC基因。結果表明其自身來源的phaCAm是最有效的。
　　 進一步對內(nèi)源phaC進行了過量表達來提高PMP的含量，并優(yōu)化得到了最佳的PHA合成酶的表達量來滿足最大化的PMP合成。我們得到了PMP產(chǎn)量最高的菌株S

14、HX22。產(chǎn)量達到20％，最高可以得到25％。對菌株SHX22的菌體干重、PMP含量和培養(yǎng)基中各組分進行了隨發(fā)酵時間的變化分析，最終發(fā)現(xiàn)3MP的“相對剩余”的現(xiàn)象。在A.mimigardefordensis菌株的細胞中，3MP分子只能快速的被轉運到胞外而不能成功的穿越細胞膜再次進入細胞。我們判斷這是導致PMP產(chǎn)量無法繼續(xù)提高的一個重要限制因素。據(jù)此提出了三種解決方案:第一種通過降低DTDP的濃度進而降低胞內(nèi)DTDP的降解速度來協(xié)調(diào)其和P

15、MP合成速度的策略，但該方法最終被證明是不可行的。第二種方法尋找一個轉運蛋白將3MP轉入胞內(nèi)比較困難，第三種策略是進一步提高3MP到3MP-CoA的轉化速率。為此我們尋找到了合適的酶，即來自Clostridiumkluyveri的cat2，并在大腸桿菌中成功的驗證了其功能。進一步驗證工作正在進行。
　　 最后我們建立了一種適合于重組菌的PMP純化方法，獲得了純的PMP產(chǎn)物，并通過GC/MS的分析確認了得到的PMP產(chǎn)物的均一性。尼

16、羅紅染色證實該菌株中的PMP是以常規(guī)的PMP顆粒的形式存在。而這種具有生物活性PMP顆粒可以使我們對其和完整PHA酶系之間的關系進行深入研究。為此我們優(yōu)化并建立了一套適合于該菌株的活性PMP顆粒的甘油密度梯度超速離心的純化方法并試著對其蛋白成分組成進行了分析。
　　 PMP材料是用生物方法人工合成的新型聚合物材料。因為材料在性質(zhì)上的優(yōu)越性，具有較高的實用價值。但其生產(chǎn)目前受限于前體底物3MP的毒性，采用低毒性的DTDP進行PMP

17、合成無疑具有很大的優(yōu)勢。本論文通過對一株可以利用DTDP進行生長的菌株A.mimigardefordensis進行異源PMP合成途徑BPEC的構建和優(yōu)化，以及之后的一系列發(fā)酵優(yōu)化改造，成功實現(xiàn)了利用低毒性DTDP為底物，在不能生產(chǎn)PMP的菌株細胞中積累到10％的PMP含量。之后，通過內(nèi)源的新的PMP合成途徑的發(fā)現(xiàn)以及之后的關鍵酶phaCAm的鑒定和優(yōu)化，將PMP胞內(nèi)含量進一步提高到了20％，最高可以達到25％.之后對合成的PMP進行了純