線粒體基因ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)變異與弱精子癥相關(guān)性的研究.pdf

1、目的：
　　 1．分析中國(guó)地區(qū)漢族人線粒體DNA（mitochondriaDNA，mtDNA）ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因與以西方白種人為主要來(lái)源的劍橋參考序列(CambridgeReferenceSequence)之間的差異，查找其突變位點(diǎn)。
　　 2．比較ND1基因核苷酸總變異率、總錯(cuò)義突變率在弱精子癥組(asthenospermia,AST)和正常對(duì)照組中的差異，探

2、討精子活力與核苷酸變異的相關(guān)性。
　　 3．比較tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因在弱精子癥組和正常對(duì)照組中核苷酸的差異，探討精子活力與核苷酸變異的相關(guān)性。
　　 4．通過(guò)對(duì)mtDNA的核苷酸變異分析，從mtDNA方面探索弱精子癥患者致病的分子機(jī)制，為其相關(guān)的分子診斷提供基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1．根據(jù)WHO對(duì)弱精子癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取漢族人群中已確診為AST患者20

3、6名，同時(shí)收集該患者的相應(yīng)臨床資料，包括年齡、精液量、精子密度、精子活力和形態(tài)及病人的睪丸、附睪直徑、輸精管大小、精索靜脈曲張情況。160名年齡匹配的健康體檢者作為正常對(duì)照，對(duì)照組精液標(biāo)本來(lái)自于經(jīng)詢問(wèn)病史后確認(rèn)夫妻結(jié)婚后女方先前已懷過(guò)孕或者經(jīng)IVF成功懷孕的男性（或者經(jīng)詢問(wèn)確認(rèn)女方原因造成的不育），生殖系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)和精液常規(guī)檢查均正常。
　　 2．參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版組織標(biāo)本中快速提取精子全基因組DNA。
　　

4、 3．提取所有受試者精子全基因組DNA，采用PCR擴(kuò)增ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因，直接測(cè)序后與劍橋參考序列(CambridgeReferenceSequence，CRS)進(jìn)行比對(duì)。
　　 4．借助生物信息學(xué)軟件ClustalX分析ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因保守性。運(yùn)用蛋白相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，從氨基酸變異情況和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析ND1基因

5、變異前后的變化。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析ND1、tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)基因變異與AST及其精子活力的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1．線粒體基因ND1變異與弱精子癥相關(guān)性的研究
　　 (1)中國(guó)漢族人群線粒體ND1基因存在大量變異位點(diǎn)，在74例弱精子癥患者中發(fā)現(xiàn)30個(gè)變異位點(diǎn)，60例正常對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)22個(gè)變異位點(diǎn)，其中14個(gè)位點(diǎn)變異在弱精子癥患者和正常對(duì)照人群中都存在。m.4

6、048G＞A突變?nèi)蹙影Y組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其它位點(diǎn)突變?cè)趦山M間差異不明顯，大部分是一些多態(tài)性的改變。
　　 (2)我們對(duì)所有位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)m.4048G＞A這個(gè)位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該位點(diǎn)的突變導(dǎo)致氨基酸由極性酸性氨基酸變?yōu)橹行园被幔赡芘c精子活力有關(guān)。
　　 (3)ND1基因核苷酸總變異率、總錯(cuò)義突變率和平均錯(cuò)義突變率在弱精子癥組和對(duì)照組中無(wú)顯著差異。
　　 (4)弱精子癥組中出現(xiàn)的30

7、個(gè)變異位點(diǎn)有26個(gè)位點(diǎn)在www.mitomap.org中已有報(bào)道，對(duì)基因變異后編碼的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)錯(cuò)義突變，22個(gè)同義突變。正常對(duì)照組中出現(xiàn)22個(gè)變異位點(diǎn)有16個(gè)位點(diǎn)在www.mitomap.org中已有報(bào)道，對(duì)基因變異后編碼的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)錯(cuò)義突變，16個(gè)同義突變。分析這些錯(cuò)義突變?cè)诓煌锓N之間的保守性表明：m.3394T＞C、m．3398T＞C、m.3571C＞T和m.3661T＞A都是進(jìn)化上的高度保守位點(diǎn)；其余位點(diǎn)(m

8、.3308T＞C，m.3316C＞A，m.3497C＞T，m.4048G＞A和m.4216T＞C)都不是進(jìn)化上的保守位點(diǎn)。
　　 (5)檢測(cè)到的所有位點(diǎn)變異，經(jīng)Mitomap數(shù)據(jù)庫(kù)中查找發(fā)現(xiàn)8個(gè)突變位點(diǎn)未見(jiàn)報(bào)道過(guò)，分別是m.3528(＞T、m.3535T＞C、m.3540T＞C、m.3627C＞G、m.3642C＞T、m.3885(＞T和m.3930C＞A。
　　 2．線粒體基因tRNAHis、tRNASer(AGY)和

9、tRNALeu(CUN)變異與弱精子癥相關(guān)性的研究
　　 (1)tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALe(CUN)基因中弱精子癥組和正常對(duì)照組與劍橋參考序列比對(duì)研究，發(fā)現(xiàn)在132例弱精子癥患者中共檢測(cè)到9個(gè)變異位點(diǎn)，其中tRNAHis基因有2個(gè)變異位點(diǎn)（分別是m.12189T＞C、m.12192G＞A），tRNASer(AGY)基因有3個(gè)變異位點(diǎn)(分別是m.12218C＞T、m.12223A＞G、m.12234A＞

10、G)，tRNALeu(CUN)基因有4個(gè)變異位點(diǎn)(分別是m.12280A＞G、m.12284C＞T、m.12285T＞C、m.12290A＞G、m．12280A＞G)。100例正常對(duì)照組中共檢測(cè)到2個(gè)變異位點(diǎn)，其中tRNAHis有一個(gè)變異位點(diǎn)(m.12192G＞A)，tRNALeu(CUN)基因有1個(gè)變異位點(diǎn)(m.12280A＞G)。
　　 (2)tRNASer(AGY)基因總變異率在弱精子癥患者中發(fā)生的頻率高于正常對(duì)照組，差異

11、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)位于在tRNASer(AGY)基因中m.12234A＞G突變?cè)谌蹙影Y患者中檢測(cè)到6例，在正常對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到，兩組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．線粒體基因ND1變異與弱精子癥相關(guān)性的研究
　　 (1)中國(guó)漢族人群線粒體ND1基因存在大量變異位點(diǎn)。m.4048G＞A位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可能與弱精子癥發(fā)病有關(guān)，有

12、待深入研究；其余位點(diǎn)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是基因多態(tài)性位點(diǎn)。
　　 (2)本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到m．3394T＞C和m.4216T＞C位點(diǎn)雖然不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變很大，可能與弱精子癥有關(guān)，需要增大樣本量進(jìn)一步研究，或從基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能方面深入研究。
　　 2．線粒體基因tRNAHis、tRNASer(AGY)和tRNALeu(CUN)變異與弱精子癥相關(guān)性的研究
　　 (1)本研究中發(fā)現(xiàn)有9個(gè)位點(diǎn)突變

13、，其中m.12189T＞C、m.12192G＞A、m.12234A＞G、m.12280A＞G和m．12285T＞C己報(bào)道過(guò)；而m.12223A＞G、m.12284(＞T、m.12290A＞G和m.12218(＞T未見(jiàn)報(bào)道。
　　 (2)本研究中發(fā)現(xiàn)3個(gè)異質(zhì)性的突變位點(diǎn)，分別是m．12189T＞C、m．12218(＞T和m．12285T＞C。
　　 (3)線粒體tRNASer(AGY)基因在弱精子癥患者中突變率高于正常對(duì)照