龍井43號茶樹PPO同工酶I-1的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、多酚氧化酶(PPO)是植物中廣泛存在的氧化還原酶，也是茶葉加工中的關(guān)鍵酶。盡管對茶葉PPO研究較多，但主要是以含多種同工酶的混合酶進行研究，缺乏深入單一同工酶的探討。本試驗從龍井43號茶樹中分離出單一的PPO同工酶Ⅰ-1(記為PPOⅠ-1)，并進行酶性質(zhì)分析等工作。
　　以龍井43號茶樹的一芽一二葉春季鮮葉為原料，利用緩沖液勻漿法提取茶葉中的PPO，并以硫酸銨沉淀、透析脫鹽和DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱層析結(jié)

2、合的方法進行分離純化，經(jīng)非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳鑒定，得到的PPOⅠ-1為電泳純。
　　對PPOⅠ-1酶學(xué)性質(zhì)（底物專一性、Km、最適pH、最適溫度、熱穩(wěn)定性、抑制劑及金屬離子的作用）進行檢測，并與粗酶進行比較。發(fā)現(xiàn)PPOⅠ-1和粗酶均以鄰苯二酚為底物時活性最高，二者對應(yīng)的Km分別是73.50 mmol/L和77.30 mmol/L。PPOⅠ-1和粗酶在酸性和堿性條件下的PPO活性都均有峰值，PPOⅠ-1的峰值在pH5.6和pH8

3、.8處，粗酶的峰值出現(xiàn)在pH5.2和pH8.4處。PPOⅠ-1和粗酶的最適反應(yīng)溫度都是35℃;PPOⅠ-1和粗酶的酶活性都在35℃下穩(wěn)定性較強，孵育6h后仍保持60％以上酶活性;45℃下孵育PPO活性加速下降，6h后PPOⅠ-1和粗酶的酶活性分別降低至6.37％和24.32％;55-75℃下孵育，PPO活性均在lh內(nèi)降低至30％以下。PPOⅠ-1的熱穩(wěn)定性整體高于粗酶，在相同溫度下處理時的酶活性比粗酶的降低慢。
　　抑制劑對PPO

4、Ⅰ-1的作用強度為Na2SO3＞L-半胱氨酸＞Vc＞檸檬酸，對應(yīng)的相對酶活性分別為3.19％、5.72％、23.88％和77.69％;抑制劑對粗酶的作用強度為Na2SO3＞Vc＞L-半胱氨酸＞檸檬酸，對應(yīng)的相對酶活性分別為2.90％、10.94％、24.59％和88.76％; EDTA-2Na對PPO活性的抑制作用弱，100.00 mmol/L的EDTA-2Na作用下PPOⅠ-1和粗酶的相對酶活性分別是92.93％和77.16％。金屬離

5、子對PPO活性的作用模式多樣:Cu2+濃度低時促使酶活性升高，濃度高時抑制酶活性低;Mg2+在不同濃度均抑制PPOⅠ-1的活性，但對粗酶的活性表現(xiàn)為低濃度抑制、高濃度促進;Fe3+和Al3+對PPOⅠ-1和粗酶均表現(xiàn)為抑制作用;Na+對PPOⅠ-1和粗酶的酶活性都沒有顯著影響。
　　PPOⅠ-1和粗酶催化生成茶黃素時，均以茶多酚濃度1.50 mg/mL、恒溫37℃、反應(yīng)時間1.0h為最適，PPOⅠ-1和粗酶催化合成茶黃素的最適反應(yīng)

6、pH分別為4.4和4.0。茶黃素單體的含量由高到低依次為TFDG、TF-3'-G、TF-3-G和TF，且單因素變化條件下各單體的含量變化趨勢基本一致，茶黃素總量的變化趨勢也保持一致。PPOⅠ-1對茶黃素的催化轉(zhuǎn)化能力強于粗酶，在較低底物濃度下即可催化合成TF-3-G、TF-3'-G和TFDG，且各反應(yīng)條件下催化合成的各茶黃素單體含量及總量均高于粗酶。
　　本試驗分離純化出龍井43號茶樹PPO同工酶Ⅰ-1，分析其酶學(xué)性質(zhì)，并與粗酶性