面向線蟲行為學(xué)分析的微流控芯片研究.pdf

1、生物的行為受到多種因素，如外部刺激、內(nèi)在環(huán)境變化、過往經(jīng)歷以及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)等影響，能夠反映神經(jīng)系統(tǒng)的活性。因此，行為學(xué)實驗正日益成為科研工作者一個簡單、靈敏的工具來研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能。多細胞模式生物秀麗隱桿線蟲具有易于培養(yǎng)、便于基因操控、繁殖周期短、神經(jīng)元連接圖譜可知等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛的用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究。
　　線蟲行為呈現(xiàn)多樣性，涵蓋了復(fù)雜多樣的爬行行為、覓食、排泄、交配、產(chǎn)卵行為以及對不同外界環(huán)境的趨向性行為。傳統(tǒng)方法是基于一個

2、開放的環(huán)境在瓊脂糖表面設(shè)計環(huán)境因素刺激線蟲觀察其行為。由于與外界環(huán)境相通，設(shè)計的環(huán)境因素不具有精確的可控性。另外，單純的瓊脂糖表面限制了刺激手段的多樣性。微流控芯片近年來發(fā)展迅速，基于其諸多的優(yōu)點，如可精確的操控、良好的透氣性，最重要的是芯片的通道尺寸和線蟲身體的尺寸能夠完美的匹配以及芯片的結(jié)構(gòu)可以多樣化設(shè)計，使得微流控芯片作為一個很好的平臺被廣泛的用于線蟲的行為學(xué)研究。本文設(shè)計了多種微流控芯片，研究了線蟲的多種行為學(xué)，探究了其機理，主

3、要研究成果如下：
　　1、提出并設(shè)計了基于柱子陣列的“泥土芯片”，模擬土壤環(huán)境，探討了線蟲對空間的感知探索行為。通過改變微柱的間距可以精確控制空間的大小，借助于觀察綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子（DAF-16）在細胞中的定位，分析線蟲對不同空間尺寸的感知。實驗發(fā)現(xiàn)，線蟲確實能夠感受到狹窄的空間，表現(xiàn)出很強的DAF-16核定位。狹窄的空間會引起脅迫反應(yīng)，推測基于PDMS薄膜形變及楔形通道實現(xiàn)線蟲固定的方法也會對線蟲產(chǎn)生脅迫反應(yīng)

4、。鑒于此，設(shè)計了一種基于氣體的無脅迫固定方法，實現(xiàn)了30 min內(nèi)的無脅迫固定，并且可逆。
　　2、行為學(xué)實驗需要大量同步化的線蟲，因為不同時期的線蟲有著各方面的特異性特征，這使得不同時期線蟲的分選意義重大。本文首先根據(jù)線蟲的偏轉(zhuǎn)電趨向性，設(shè)計了扇形的PDMS和瓊脂糖的雜合芯片，在10 V/cm的電場強度下首次高效的實現(xiàn)了不同時期線蟲的同步化分選。基于線蟲電趨向性，設(shè)計了PDMS和瓊脂糖的雜合多級過濾芯片，實現(xiàn)了不同時期線蟲的同步

5、化高通量分選。
　　3、在過濾分選時發(fā)現(xiàn)，線蟲爬過柱子陣列的時間逐漸減少，推測是一種學(xué)習(xí)行為。研究發(fā)現(xiàn)，整個學(xué)習(xí)過程很快，但記憶時間很短，機械感知神經(jīng)元在這一過程中發(fā)揮重要作用。本文進一步設(shè)計了可實現(xiàn)雙重刺激的芯片，探討了機械感知和食物的聯(lián)合學(xué)習(xí)和記憶行為。實驗發(fā)現(xiàn)，該學(xué)習(xí)行為具有可塑性并有長時間的記憶。不同的機械感知和神經(jīng)遞質(zhì)的突變會減弱學(xué)習(xí)能力或者記憶。內(nèi)源性多巴胺信號的加強能夠延長記憶的時間，但不會影響學(xué)習(xí)能力。4 mM的外

6、源性多巴胺不僅增強了學(xué)習(xí)能力，還延長了記憶時間。
　　4、基于線蟲的化學(xué)趨向性，本文設(shè)計了簡單的PDMS和瓊脂糖的旋轉(zhuǎn)芯片，探究了線蟲在不同條件下的信息交流行為。實驗發(fā)現(xiàn)，在饑餓的條件下，線蟲留下的信息會使后續(xù)線蟲產(chǎn)生回避行為。在有食物的條件下，少量線蟲短時間留下的信息會產(chǎn)生趨向性行為，隨著線蟲數(shù)量的增多以及時間的延長，逐漸變?yōu)榛乇苄袨椤＿M一步研究發(fā)現(xiàn)，雌雄同體和雄性體各自的信息交流策略不同，即使在饑餓的條件下，雄性體留下的信息也

7、不會引起回避行為。利用此方法可進一步研究兩性之間的相互交流。
　　綜上所述：本文發(fā)展了微流控芯片新方法，研究了線蟲的空間感知探索行為，設(shè)計了一種基于氮氣的無脅迫的可逆固定方法；基于線蟲的偏轉(zhuǎn)電趨向性行為首次實現(xiàn)了不同時期的同步化分選，并在電場驅(qū)動下通過多級過濾的方法進一步提高了分選通量、效率和純度；探討了線蟲基于機械感知的非聯(lián)合型和聯(lián)合型學(xué)習(xí)行為；基于線蟲的化學(xué)趨向性探究了同性以及異性之間在不同條件下的信息交流行為，發(fā)現(xiàn)了交流策略