納米及生物放大技術(shù)構(gòu)建信號增強型電化學(xué)適體傳感器的研究.pdf

1、電化學(xué)適體傳感器通過測定適體與目標物作用前后電化學(xué)信號的變化來實現(xiàn)對目標分析物的定量檢測，具有操作簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點。將材料、生物及化學(xué)等多種放大技術(shù)結(jié)合，是實現(xiàn)高靈敏檢測的有效方法。本文主要從功能化納米復(fù)合物的制備，電極敏感界面的構(gòu)建，新型信號放大手段的運用以及檢測通量的提高等方面來構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器，并對其原理及性能等進行了探索和研究。研究工作分為以下幾個部分:
　　1.雙酶功能化的空心鉑鈷納米鏈為信號

2、探針構(gòu)建凝血酶電化學(xué)適體傳感器
　　采用模板法原位還原合成空心鉑鈷納米鏈，用于修飾電活性物質(zhì)二茂鐵標記的凝血酶適體，再與葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物模擬酶結(jié)合，制得適體和雙酶功能化的空心鉑鈷納米鏈復(fù)合物。本研究基于該納米復(fù)合材料作為信號探針成功制得了一種夾心型的凝血酶電化學(xué)適體傳感器。利用該空心納米鏈大的比表面積，可有效提高電活性物質(zhì)和雙酶的固載量，增強電化學(xué)響應(yīng)信號。當檢測底液中存在葡萄糖時，葡萄糖氧化酶首先催化葡萄糖產(chǎn)生H2O2

3、，生成的H2O2再通過辣根過氧化物模擬酶和納米鉑的催化，從而進一步增強二茂鐵的電化學(xué)響應(yīng)信號，提高檢測的靈敏度。實驗結(jié)果表明，利用空心鉑鈷納米鏈作為固載基質(zhì)可有效放大分析信號，提高適體傳感器的靈敏度。
　　2.葡萄糖氧化酶功能化復(fù)合物的直接電化學(xué)及電催化放大構(gòu)建凝血酶適體傳感器
　　在玻碳電極表面修飾一層樹枝狀聚氨基胺-碳納米管復(fù)合物膜作為傳感器的敏感界面，利用聚氨基胺表面大量的官能團以及碳納米管空心管狀結(jié)構(gòu)具有大的比表面積

4、，在增加修飾電極有效面積的同時提高凝血酶適體的捕獲量。此外，本研究制備了納米鉑功能化的還原石墨烯復(fù)合物（PtNPs@rGO），利用該復(fù)合物良好的生物相容性及大的活性表面在提高葡萄糖氧化酶(GOD)和適體固載量的同時保持其良好的生物活性，并以此構(gòu)建了夾心型凝血酶適體傳感器。利用葡萄糖氧化酶的直接電子傳遞及催化作用，并結(jié)合納米鉑的協(xié)調(diào)催化來實現(xiàn)檢測信號的放大，提高檢測的靈敏度。本實驗對制備的復(fù)合納米材料進行了表征，并對傳感器的響應(yīng)性能進行了

5、研究。結(jié)果表明該方法切實可行，具有檢測限低、選擇性好等特點。
　　3.酶的直接電化學(xué)和生物放大技術(shù)構(gòu)建凝血酶適體傳感器
　　本研究利用辣根過氧化物酶的直接電化學(xué)，并結(jié)合兩種新型生物放大技術(shù)，即目標物循環(huán)和雜交鏈式反應(yīng)，實現(xiàn)了對于凝血酶的高靈敏檢測。首先將巰基標記的捕獲探針與凝血酶適體鏈互補形成雙鏈并通過Au-S鍵固載到納米金修飾的玻碳電極表面;當目標物凝血酶存在時，適體-凝血酶復(fù)合物的形成使得雙鏈被破壞，同時在外切酶作用下將

6、與凝血酶結(jié)合的適體進行剪切，使得目標物凝血酶重新被釋放和循環(huán)。隨后，將電極表面得到的單鏈捕獲探針作為引發(fā)劑，與另外兩條兩端標記生物素的發(fā)夾型DNA進行雜交鏈式反應(yīng)，使得電極表面含有大量生物素標記的雙鏈聚合物結(jié)構(gòu)，從而可以引入大量親和素標記的辣根過氧化物酶，利用辣根過氧化物酶的直接電子傳遞以及其自身的催化提高檢測的電化學(xué)信號，進一步提高傳感器的靈敏度。
　　4.石墨烯復(fù)合納米材料與生物放大技術(shù)構(gòu)建信號增強型電化學(xué)適體傳感器用于內(nèi)毒素

7、的超靈敏檢測
　　目前，利用內(nèi)毒素適體作為分子識別元件構(gòu)建適體傳感器來檢測內(nèi)毒素的方法少有報告，且靈敏度并不理想。因此，本研究利用三條DNA通過部分雜交形成的Y型連接體標記和剪切酶誘導(dǎo)的目標物循環(huán)放大，并結(jié)合納米材料的信號放大構(gòu)建了一種新型的信號增強型電化學(xué)適體傳感器用于內(nèi)毒素的超靈敏檢測。石墨烯與電活性物質(zhì)甲苯胺藍通過π-π堆積作用形成的復(fù)合物能有效提高甲苯胺藍的固載量，放大電化學(xué)信號，從而提高傳感器的靈敏度。同時，Y型連接體標

8、記的應(yīng)用使得剪切酶的識別位點不局限于特點序列的目標DNA，只要將其中兩條DNA（捕獲探針和輔助探針）的堿基序列進行相應(yīng)的改變，該方法對于其他目標生物分子的檢測具有通用性。
　　5.碳納米管和石墨烯雙重放大的電化學(xué)適體傳感器用于多組分的同時檢測
　　為了提高適體傳感器的檢測通量，本研究以功能化的石墨烯納米復(fù)合物作為信號標記，構(gòu)建了一種新型的夾心型電化學(xué)適體傳感器，實現(xiàn)了在同一敏感界面對于血小板源性生長因子和凝血酶的同時檢測。采

9、用還原石墨烯作為載體通過化學(xué)鍵合作用修飾不同的電活性物質(zhì)，隨后在其表面原位還原產(chǎn)生納米鉑，用于固載對應(yīng)的不同適體及葡萄糖氧化酶和辣根過氧化物酶，形成了多重標記的石墨烯納米復(fù)合物。同時，采用納米金包覆的單壁碳納米管增加電極的有效表面積來增加適體的捕獲量，進一步增加石墨烯納米復(fù)合物的固載量。實驗結(jié)果表明該復(fù)合物具有良好的電化學(xué)氧化還原活性，結(jié)合納米鉑與雙酶良好的協(xié)同電催化活性，進一步放大電化學(xué)信號，從而實現(xiàn)了對于兩種目標蛋白同時檢測的高特異