近膜區(qū)域熒光顯微圖像中亞細(xì)胞目標(biāo)的斑點(diǎn)檢測(cè)、融合事件識(shí)別和三維形態(tài)重建.pdf

1、隨著光學(xué)顯微技術(shù)的進(jìn)步，全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescencemicroscopy，TIRFM)相比于傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)研究方法（如免疫細(xì)胞化學(xué)、基因技術(shù)、亞細(xì)胞分層等）能夠?qū)崟r(shí)觀(guān)察細(xì)胞膜附近區(qū)域內(nèi)的亞細(xì)胞目標(biāo)（如轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡、自噬溶酶體、細(xì)胞骨架等），并定量分析其結(jié)構(gòu)形態(tài)和動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)特性（如微管結(jié)構(gòu)，胞吞胞吐過(guò)程中的囊泡運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞遷移等）。但由于所觀(guān)察的對(duì)象特征復(fù)雜、運(yùn)動(dòng)模式多變，人工分

2、析海量的TIRFM圖像數(shù)據(jù)不僅十分繁瑣，分析結(jié)果錯(cuò)誤率往往較高。因此，利用計(jì)算機(jī)圖像處理技術(shù)對(duì)顯微圖像進(jìn)行自動(dòng)分析，并提供客觀(guān)的定量數(shù)據(jù)幫助量化并驗(yàn)證所觀(guān)察到的生命活動(dòng)就顯得尤為重要。
　　細(xì)胞膜附近區(qū)域葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，Glut)囊泡的運(yùn)動(dòng)情況和徽管細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)形態(tài)與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制密切相關(guān)。針對(duì)近膜區(qū)域內(nèi)常見(jiàn)的Glut4囊泡、自噬溶酶體以及微管細(xì)胞骨架等亞細(xì)胞目標(biāo)的TIRFM圖像，本論文開(kāi)

3、展如下工作:熒光顯微圖像降噪，顯微圖像中特征斑點(diǎn)的檢測(cè)，Glut4囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜融合過(guò)程的自動(dòng)識(shí)別，以及利用多角度TIRF成像技術(shù)重建微管在近膜區(qū)域的三維形態(tài)。論文主要成果及創(chuàng)新點(diǎn)包括:
　　(1)在分析熒光顯微圖像形成的基礎(chǔ)上，提出基于小波多尺度求和(wavelet multiscaleaddition，WMA)的圖像降噪方法。不同信噪比的模擬圖像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于線(xiàn)性濾波，高斯平滑濾波以及小波多尺度方差穩(wěn)定變換算法，WMA算法

4、擁有更優(yōu)的降噪效果。WMA算法在C2C12骨骼肌細(xì)胞Glut4囊泡和微管圖像中的降噪效果也得到了驗(yàn)證。
　　(2)建立了根據(jù)熒光斑點(diǎn)的亮度均值和方差構(gòu)建特征空間實(shí)現(xiàn)顯微圖像中的特征斑點(diǎn)檢測(cè)(feature particle detection，F(xiàn)PD)算法。模擬圖像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在信噪比很低(SNR=1)時(shí)，F(xiàn)PD算法的準(zhǔn)確檢測(cè)率仍能達(dá)到87％。在胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬溶酶體的檢測(cè)中，F(xiàn)PD算法優(yōu)于ImageJ軟件自帶的Analyz

5、e articles(AP)算法，與人工識(shí)別效果的擬合度達(dá)到93％。
　　(3)基于pH值敏感性熒光蛋白VAMP2-pHluorin標(biāo)記Glut4囊泡，應(yīng)用移動(dòng)平均差分算法結(jié)合自適應(yīng)閾值（中值絕對(duì)偏差）能從TIRF圖像序列中檢測(cè)出備選Glut4融合囊泡并確定融合起始幀數(shù)。通過(guò)對(duì)備選Glut4融合囊泡進(jìn)行逐幀二維Gaussian擬合，得到融合過(guò)程中囊泡的參數(shù)變化情況，以此判斷備選Glut4囊泡融合過(guò)程屬于完全融合(fullfusio

6、n)還是部分融合（partial fusion）。三組已知真實(shí)融合信息的3T3-L1脂肪細(xì)胞TIRF圖像序列用于驗(yàn)證識(shí)別算法的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明備選Glut4融合囊泡準(zhǔn)確檢測(cè)率達(dá)到96.5％，融合過(guò)程準(zhǔn)確識(shí)別率達(dá)到84.3％。
　　(4)結(jié)合多角度TIRF顯微技術(shù)得到圖像的更多空間深度信息，擬合不同入射角下激光的透射強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了觀(guān)察目標(biāo)的三維形態(tài)重建。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在信噪比為2時(shí)，探測(cè)深度在300nm范圍內(nèi)的定位精度能達(dá)到40nm