四種有機磷農藥核酸適體的篩選、鑒定及其活性研究.pdf

1、有機磷農藥是我國廣泛使用的殺蟲劑，國家標準規(guī)定農產品中有機磷農藥的最大允許殘留量為0.2 mg/kg，但近年來由于不合理的使用已嚴重的危害到我國的食品安全，因此發(fā)展快速的農藥殘留檢測技術尤為重要。核酸適體(Aptamer)作為一種具有替代抗體潛能的新型仿生生物識別元素，是近年來研究的熱點。在食品安全領域，已有抗生素、重金屬、食源性致病菌、生物毒素等多種物質的核酸適體被成功篩選和應用，但目前關于有機磷農藥核酸適體的篩選和應用還鮮見報道。本

2、研究利用SELEX技術對甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果四種有機磷農藥的DNA適體進行了篩選，并對篩選獲得的適體的親和活性、特異性及活性位點進行了研究，主要研究內容及結果如下:
　　 1.適體SELEX篩選中單鏈DNA的制備
　　 探討了在適體SELEX篩選中，利用凝膠捕獲法制備單鏈DNA(ssDNA)的試驗條件，為適體SELEX篩選中次級庫的生成奠定基礎。將PCR擴增后帶生物素和熒光標記的dsDNA連接在鏈霉親和素標

3、記的凝膠上，用NaOH變性解鏈制備ssDNA。結果表明:dsDNA與凝膠結合的時間40 min為佳;NaOH的濃度0.1 mol/L較適宜。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定表明優(yōu)化試驗條件下制備的產物為ssDNA。這種制備ssDNA的方法操作簡單、方便、所需時間短，制備的ssDNA帶有熒光標記，便于用熒光法監(jiān)控適體的篩選過程，對于適體SELEX篩選中次級庫的生成是很好的選擇。
　　 2.四種有機磷農藥DNA適體的篩選
　　

4、 利用SELEX技術從一個固定的隨機ssDNA庫中同時篩選甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果四種有機磷農藥的DNA適體。隨著篩選輪數(shù)的增加，四種有機磷農藥從固定的隨機庫中洗脫的ssDNA逐漸富集，經過12的輪篩選，篩選效率達到40.8％;對第12輪洗脫的ssDNA進行克隆、測序，挑選的15個陽性克隆均測序成功，由于部分克隆具有完全一致的序列，最終篩選到5條ssDNA序列;一級結構序列分析表明5條ssDNA具有一定的同源性，二級結構預測表

5、明5條ssDNA的二級結構主要以莖環(huán)結構為主，莖環(huán)結構可能是適體結合四種有機磷農藥的基礎。
　　 3.適體活性鑒定方法的建立
　　 建立了基于結構轉換信號和分子信標的兩種鑒定適體活性的熒光檢測策略，優(yōu)化了熒光檢測條件，并比較了兩種方法的檢測效果?；诮Y構轉換信號的適體活性鑒定方法的影響因素試驗表明:試劑本底、游離態(tài)的猝滅序列Q-B、四種有機磷農藥對反應體系熒光強度的影響較小，表明該熒光策略具有一定的可行性，熒光序列F-P

6、1與猝滅序列Q-B的添加比例為1∶2時，就能達到很好的熒光猝滅效果?；诜肿有艠说母偁幰种品ǖ臈l件試驗表明:設計的分子信標的發(fā)夾結構既能夠成功閉合也能夠成功被核酸適體打開，丙酮及四種有機磷農藥對分子信標的發(fā)夾結構影響較小，分子信標性能穩(wěn)定;適體與分子信標的添加比例為1∶1.25，孵育時間為50 min，孵育溫度為室溫，農藥靶分子在分子信標之前加入能夠取得較好的試驗結果。兩種方法對混合適體的活性鑒定效果表明:基于結構轉換信號的方法熒光強度

7、變化較小，熒光回復率較低，不能很好的對適體活性做出判斷;基于分子信標的競爭抑制法檢測效果明顯，更適用于適體的活性鑒定。
　　 4.適體的活性、特異性鑒定
　　 利用建立的基于分子信標的競爭抑制法對篩選到的5條ssDNA進行了活性鑒定，5條ssDNA中SS2-55和SS4-54對四種有機磷農藥表現(xiàn)出了較強的結合活性，水胺硫磷的抑制率高達75％以上，其它三種有機磷農藥抑制率最低的也在39％以上。對于活性較高的SS2-55和S

8、S4-54適體利用9種結構相似的農藥進行了特異性分析，結果表明兩條適體對九種農藥的結合活性很低，抑制率都在15％以下。利用熒光結合超濾的方法對其平衡解離常數(shù)(Kd)進行了測定，結果表明SS2-55和SS4-54適體對四種有機磷農藥的平衡解離常數(shù)在0.83～2.5μmol/L之間。這些結果說明SS2-55和SS4-54適體對四種有機磷農藥的親和活性、特異性較高，可能是結合四種有機磷農藥的廣譜型適體。
　　 5.適體活性位點的研究與

9、分析
　　 利用適體剪切和拼接的手段對SS2-55和SS4-54適體進行了結構改造，并利用基于分子信標的競爭抑制法對改造的適體的活性進行了鑒定，根據(jù)結構改造前后適體活性的變化探索了適體結合四種有機磷農藥的活性位點;并利用紫外光譜法研究了四種有機磷農藥和四種堿基的相互作用，結合適體結構改造的結果，進一步分析了適體Loop環(huán)上的結合位點。基于適體剪切的活性位點分析表明:對于SS2-55適體，Loop2-4是四種有機磷農藥共有的活性位

10、點，尤其對于氧化樂果至關重要;Loop2-3是識別甲拌磷的重要活性位點;Loop2-1、Loop2-2是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位點。對于SS4-54適體5'端和3'端殘余的核苷酸對甲拌磷和氧化樂果是重要的活性位點，Loop4-2、Loop4-1是丙溴磷和水胺硫磷共有的活性位點;Loop4-3是丙溴磷和氧化樂果共有的活性位點。基于適體片段拼接的適體活性位點分析表明:適體與農藥靶分子的結合并不是簡單的活性部位的堆積，有的活性部位可能不是

11、結合部位，但它卻對維持適體的活性有一定作用;幾個堿基的不同就可能引起適體活性很大的變化。紫外吸收光譜研究結果表明:四種有機磷農藥對四種堿基的紫外吸收光譜都有一定程度的影響，使四種堿基的吸收峰發(fā)生了紅移和減色效應;四種有機磷農藥中，水胺硫磷與胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤的相互作用最強，氧化樂果與鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶的相互作用其次，而甲拌磷、丙溴磷與堿基之間的相互作用較弱。Loop環(huán)上的T、C堿基是水胺硫磷重要的結合位點，A、G堿基是氧化樂果