基于HMGB1-RAGE軸相關(guān)細胞因子譜的慢性阻塞性肺疾病表型探索性研究.pdf

1、背景：
　　慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructivepulmonarydisease,COPD）是一種以氣流受限和慢性氣道炎癥為特征的呼吸道疾病，是在世界范圍內(nèi)重要的致殘、致死性疾病。COPD在發(fā)病機制、病理生理學(xué)、臨床表現(xiàn)、疾病進展、對治療的反應(yīng)性等方面均存在明顯的異質(zhì)性，表明其是一種異質(zhì)性疾病。COPD表型（phenotype）正是基于這種異質(zhì)性而提出。目前研究表明，多種炎癥因子參與COPD疾病發(fā)生發(fā)展和氣道炎癥

2、的啟動和維持，對COPD細胞因子譜表達狀況及其與臨床表型間的關(guān)系進行綜合研究，不僅可使我們更深入地認識COPD的異質(zhì)性，并由此制定出具有針對性的治療方案，改善疾病預(yù)后，還有利于對COPD潛在的治療靶點選擇。
　　高遷移率族蛋白B1（HighMobilityGroupBox1，HMGB1）作為一種重要的報警素（alarmin）分子，已被證明在肺部慢性炎癥的發(fā)病機制中扮演重要角色。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptorofadvan

3、cedglycationendproducts，RAGE)是HMGB1的受體之一，RAGE平衡的異常調(diào)節(jié)參與多種氣道慢性炎癥性疾病和氣道重塑。越來越多的證據(jù)表明HMGB1-RAGE軸及其相關(guān)細胞因子在COPD發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對HMGB1-RAGE軸相關(guān)細胞因子譜的綜合研究對COPD發(fā)病機制的研究有重要意義。
　　基于上述事實，我們假設(shè)（1）COPD的炎癥表型是由不同細胞因子相互作用的結(jié)果；（2）通過細胞因子可以識別出有顯著臨

4、床特征的COPD表型，從而更好地闡述COPD的異質(zhì)性。為了驗證該假設(shè)，我們檢測了40例穩(wěn)定期COPD患者和40例正常對照者血清和誘導(dǎo)痰中涵蓋了HMGB1-RAGE軸相關(guān)細胞因子譜的22種細胞因子的水平（GM-CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-28A、IFNγ、MIP-3α、TGFβ1、TNFα、TNFβ

5、、HMGB1、sRAGE），然后嘗試通過對血清及痰細胞因子表達信息的系統(tǒng)聚類，以期識別出具有顯著臨床特征的COPD表型。
　　第一章：臨床資料的收集和血清和誘導(dǎo)痰細胞因子檢測
　　目的：收集受試者臨床資料和血清及誘導(dǎo)痰細胞因子譜，在未區(qū)分COPD表型的情況下對穩(wěn)定期COPD患者的臨床資料、血清和誘導(dǎo)痰細胞因子譜進行初步分析，并為后續(xù)數(shù)據(jù)分析作準備。
　　研究對象與方法：選取穩(wěn)定期COPD患者40例作為病例組，正常對照組

6、40例，考慮到吸煙作為COPD一個獨立的危險因素，在數(shù)據(jù)分析中進一步將健康對照組按吸煙狀況切分為2個亞組，分別為正常吸煙組（Healthysmokers,HS）20例、正常非吸煙組（Healthynone-smokers,HNS）20例。所有受試者均已簽署受試者知情同意書，并行肺功能檢查確定分組，收集一般人口學(xué)資料、MMCR評分、CAT評分等資料，并采集受試者當(dāng)天的肺功能結(jié)果、誘導(dǎo)痰樣本并抽取空腹靜脈血。誘導(dǎo)痰樣本進行細胞分類計數(shù)并留取

7、痰上清。所有受試者均抽取空腹靜脈血，行血細胞分類，并分離血清。檢測22種細胞因子水平。
　　結(jié)果：COPD組與正常對照組血清細胞因子表達量比較，COPD組血清IL-1β、IL-6、IL-22水平均高于正常對照組[1.50（0.00-9.68）pg/ml，3.10（0.00-8.50）pg/ml，141.15（40.55-225.58）pg/mlVS0.00（0.00-2.65）pg/ml，0.00（0.00-4.75）pg/ml，

8、67.35（0.00-138.70）pg/ml]；COPD組血清sRAGE水平[463.13±175.05pg/ml]顯著低正常對照組[580.24±249.90pg/ml]；COPD組與正常對照組痰細胞因子表達量比較，COPD組痰IL-1β、IL-6、IL-12p70水平低于正常對照組[1.50（0.00-9.68）pg/ml，3.10（0.00-8.50）pg/ml，0.15（0.00-0.88）pg/mlVS29.50（7.00-

9、156.00）pg/ml，80.75（39.38-159.00）pg/ml，0.75（0.00-2.50）pg/ml]；COPD組痰IL-13、HMGB1高于正常對照組[7.65（0.10-14.33）pg/ml，348（180.75-881.46）ng/mlVS4.25（0.00-17.63）pg/ml，54.94（64.22-265.57）ng/ml]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　亞組分析：COPD組血IL-1β為

10、1.50（0.00-9.68）pg/ml，顯著高于HS組[0.00（0-2.85）pg/ml，P=0.031]和HNS組[0.00（0.00-2.35）pg/ml，P=0.046]，HS組與HNS組比較無顯著差異（P=0.989）；COPD組血IL-6為3.10（0.00-8.50）pg/ml，顯著高于HNS組[0.00（0.00-2.75）pg/ml，P=0.025]，與HS組[1.55（0.00-8.00）pg/ml]比較無顯著差異

11、（P=1.000），HS組與HNS組比較亦無顯著差異；三組間血清sRAGE水平比較，COPD組血清sRAGE[463.13±175.05ng/ml]顯著低于HNS組[658.99±250.95ng/ml，P=0.001]，與HS組[501.49±228.38ng/ml]比較無顯著差異（P=056），HS組與HNS比較，HS組血sRAEG水平亦顯著低于HNS組（P=0.020）；
　　COPD組痰IL-1β為194.75（42.75

12、-666.13）pg/ml，顯著高于HS組[26.25（4.875-105.88）pg/ml，P=0.000）]和HNS組[80.00（7.00-272.50）pg/ml，P=0.036]，HS組和HNS組間痰IL-1β水平無顯著差異（P=0.517）；COPD組痰IL-4為1.00（0.00-3.25）pg/ml，顯著高于HS組[0.00（0.00-0.00）pg/ml，P=0.022]和HNS組[0.00（0.00-0.00）pg/

13、ml，P=0.018]，HS組和HNS組間痰IL-4水平無顯著差異（P=1.000）；三組間痰IL-6比較，COPD組痰IL-6為296.75（69.38-697.25）pg/ml，顯著高于HS組[74.5(39.375-132.13)pg/ml，P=0.011]和HNS組[92.5(31.13-188.13)pg/ml，P=0.040]，HS組和HNS組間痰IL-6水平無顯著差異（P=1.000）；三組間痰IL12p70比較，COPD

14、組痰IL12p70為2.50（0.13-5.50）pg/ml，顯著高于HNS組[0.00（0.00-2.25）pg/ml，P=0.018]，與HS組[1.50（0.00-3.25）pg/ml]比較無顯著差異（P=1.000），HS組和HNS組間痰IL12p70水平無顯著差異（P=0.347）；三組間痰IL-17比較，COPD組痰IL-17為7.75（0.00-0.18）pg/ml，顯著高于HNS組[0.00（0.00-3.50）pg/m

15、l，P=0.028]，與HS組[1.75（0.00-6.38）pg/ml]比較無顯著差異（P=0.292），HS組和HNS組間痰IL-17水平無顯著差異（P=1.000）。三組間痰HMGB1比較，COPD組痰HMGB1水平[348（180.75-881.46）ng/ml]顯著高于HS組[132.51（65.96-237.97）ng/ml，P=0.008]和HNS組[162.22（53.27-343.81）ng/ml，P=0.003]，H

16、S組和HNS組間痰HMGB1水平無顯著差異（P=1.000）。
　　結(jié)論：（1）臨床資料的獲取、芯片檢測和ELISA檢測均成功。（2）不考慮COPD異質(zhì)性，將正常對照組和COPD組比較可能會掩蓋了某些COPD亞型的分子特征。
　　第二章COPD臨床資料與血清及誘導(dǎo)痰細胞因子的相關(guān)性分析
　　目的：在未區(qū)分COPD表型的情況下，對COPD臨床資料與血清及誘導(dǎo)痰細胞因子的表達量進行相關(guān)性分析。
　　對象與方法：對象為

17、納入的COPD病例（40例）。分析反映COPD病情的臨床指標與血清及痰細胞因子之間的相關(guān)性。這些臨床指標包括：舒張前第一秒用力呼氣容積占預(yù)計值的百分比（FEV1％pred）、肺功能各項指標、CAT評分、mMRC評分、誘導(dǎo)痰細胞計數(shù)等。
　　結(jié)果：血清sRAGE與FEV1%pred呈正相關(guān)（r=0.360，P=0.022），與肺功能嚴重程度呈負相關(guān)（r=-0.384，P=0.015）；痰Neu計數(shù)與血清IL-5水平呈負相關(guān)（r=-0

18、.328，P=0.039），與血清IL-17水平負相關(guān)（r=-0.387，P=0.011），與血清TNFβ水平呈正相關(guān)（r=-0.352，P=0.026）；痰Neu計數(shù)與痰TGF-β1水平正相關(guān)（r=0.387，P=0.014）；痰Eos計數(shù)與痰TGF-β1水平負相關(guān)（r=-0.458，P=0.003）；外周血Neu、Eos計數(shù)與血清細胞因子表達量的相關(guān)性分析顯示：外周血Neu計數(shù)（%）與各項血清細胞因子相關(guān)性均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.0

19、5），血Eos計數(shù)與血清MIP-3α水平（r=0.390，P=0.013）呈正相關(guān)；外周血Neu、Eos計數(shù)與痰細胞因子表達量的相關(guān)性分析顯示：外周血Neu計數(shù)（%）與痰HMGB1水平正相關(guān)（r=0.330，P=0.037），血Eos計數(shù)與痰IL-2水平（r=0.352，P=0.026）、IL-12p70水平（r=0.438，P=0.005）、IL-17水平（r=0.345，P=0.029）等呈正相關(guān)，上述相關(guān)性均有統(tǒng)計學(xué)意義，其余大部

20、分臨床指標與血清及痰細胞因子表達量的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：COPD發(fā)病機制復(fù)雜，存在明顯的異質(zhì)性。不區(qū)分COPD亞型，難以較好地從機制上解釋COPD臨床資料與血清細胞因子之間的關(guān)系。
　　第三章：COPD表型的探索性研究
　　目的：本部分基于COPD患者血清及誘導(dǎo)痰細胞因子表達譜，嘗試通過聚類分析（系統(tǒng)聚類、主成分系統(tǒng)聚類）進行分子表型的探討，分析不同分子表型的臨床特征，并試圖從機制上解釋表型間臨床差異。

21、r>　　對象與方法：對象同第一部分。方法：對入選的40例COPD患者的血清細胞因子表達譜的表達量進行聚類分析，得出若干分子表型，然后比較表型之間在臨床特征的差異。
　　結(jié)果：通過對血清和痰sRAGE的綜合水平對COPD患者進行系統(tǒng)聚類，識別出2個具有顯著臨床特征的表型：表型1（sRAGE低表達型）：年齡組稍高，吸煙量（包/年）相對較少，CAT評分及mMRC評分值較高，癥狀相對較重，住院次數(shù)較多，痰Neu及Eos計數(shù)較高，肺功能GO

22、LD分級以3-4級為主，痰和血sRAGE水平較低，血清HMGB1水平較高；表型2（sRAGE高表達型）：年齡組稍低，吸煙量相對較多，CAT評分及mMRC評分值較低，癥狀相對較輕，住院次數(shù)較少，痰Neu及Eos計數(shù)較低，肺功能GOLD分級以1-2級為主，血和痰sRAGE高表達，痰IL-10、IL-13水平升高，血清HMGB1水平相對較低。血清和痰細胞因子表達譜全部數(shù)據(jù)進行主成分提取和系統(tǒng)聚類均未能識別出具有顯著臨床特征的分子表型。