快速檢測致病性微生物的免疫生物傳感器研究.pdf

1、食源性疾病不僅嚴重地損害人類的健康，也給經(jīng)濟造成重大影響，已成為國際上最突出的公共衛(wèi)生問題之一。致病性微生物污染是影響食品安全的罪魁禍首。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測方法雖然靈敏可靠，但費時、操作繁瑣、檢測結果滯后。PCR、ELISA等快速檢測方法昂貴、只能由專業(yè)人員操作，體積較大，攜帶不太方便，不適合于現(xiàn)場或野外使用，而生物傳感器在微生物檢測的實際應用中潛力巨大。
　　 免疫生物傳感器具有快速、便攜、特異性強、制作簡單、識別靈敏等特點

2、，因此成為微生物檢測領域的研究熱點。本論文以代表性食源性致病菌大腸桿菌O157：H7和典型性禽流感病毒H5N1為檢測對象，結合納米技術與電化學阻抗譜技術，分別研究了壓電和電化學免疫生物傳感器用于致病性微生物的檢測方法。
　　 本文的主要內容和研究結果如下：
　　 (1)研究了基于MPA自組裝膜技術制作的流動式壓電免疫傳感器對大腸桿菌O157：H7進行檢測。結果顯示：菌液濃度在2.2×105～2.2×108CFU/mL范圍

3、時，直接法壓電免疫傳感器的頻率變化與菌液濃度的對數(shù)值存在線性關系，回歸方程：y=-6.7 LogN+22.8，決定系數(shù)R2為0.9171。最低檢測限為2.2×105 CFU/mL。為有效地固定抗體，用循環(huán)伏安研究了MPA不同的修飾時間。結果表明：12個小時足夠使電極表面鋪滿MPA。石英晶體微天平(QCM)和循環(huán)伏安兩種方法很好地表征了傳感器的制作和檢測過程。
　　 (2)探索了檢測大腸桿菌O157：H7的基于納米金線的壓電免疫傳

4、感器的建立。納米金線通過1，6-己二硫醇作為中間試劑共價結合到電極金表面；采用蛋白A吸附將抗體固定到納米金線上。結果顯示：在流動池中固定納米金線的方法是不可行的；在氣相中浸泡的方式可以將大量的納米金線修飾到電極表面；納米金線溶液中的十六烷基三甲基澳化銨使蛋白A和納米金線的吸附受阻，直接影響到抗體的固定效果；且該表面活性劑無法清洗干凈；SEM證明了該試劑對目標檢測信號造成嚴重干擾。
　　 (3)建立了基于納米金顆粒(30 nm)制

5、作的壓電免疫傳感器檢測大腸桿菌O157：H7。采用雙硫醇在金電極表面修飾納米金顆粒，抗體通過自組裝MHDA膜固定。結果表明：超級Piranha試劑清洗QCM金電極對固定納米金顆粒非常有效；該免疫傳感器對目標菌的響應在低濃度時優(yōu)勢更明顯；未經(jīng)離心的大腸桿菌O157：H7溶液中的雜質能夠引起該免疫傳感器很明顯的非特異性信號；與控制組對比，該免疫傳感器的檢測限降低了一個數(shù)量級，且已經(jīng)達到理論計算上的最低檢出濃度。SEM驗證了納米金顆粒在QCM

6、金電極表面的固定和該免疫傳感器對大腸桿菌O157：H7的捕捉以及檢測。
　　 (4)研究了一種基于納米磁珠(30 nm)信號放大的QCM免疫傳感器對禽流感病毒H5N1進行檢測。多克隆抗-H5抗體通過MHDA自組裝膜固定到QCM金電極表面。采用生物素-鏈霉親和素體系在納米磁珠表面修飾抗-H5抗體。研究顯示：D-biotin和BSA聯(lián)用對納米磁珠表面進行封閉時，納米磁珠的非特異性響應最??；納米磁珠對信號的放大作用在低滴定度時更有效；

7、且使檢測限降低了兩個數(shù)量級。在0.128～12.8 HA單位范圍內，頻率的變化和禽流感病毒H5N1滴定度的對數(shù)值呈良好的相關關系，回歸方程：△f=-37.67LogN-44.295，決定系數(shù)R2=0.99：最低檢測限為0.0128 HA單位。在用于咽拭子樣品檢測中，檢測下限為0.128 HA單位；在0.128～12.8 HA單位范圍內，頻率響應和病毒滴定度的對數(shù)值之間存在線性關系?；貧w方程是△f=-15.835 LogN-23.969，

8、決定系數(shù)R2=0.87。該免疫傳感器對H5N1檢測的特異性強、重復性好，能夠從其他亞型(H3N2、H2N2、H4N8)中檢測出H5N1。QCM傳感器的實時響應圖和ESEM可以很好的表征該免疫傳感器的制作過程、目標捕獲以及納米磁珠對目標信號的放大。
　　 (5)論證了石英晶體金電極作為工作電極、利用法拉第阻抗譜技術快速檢測大腸桿菌O157：H7的無標記型電化學免疫傳感器的可行性。提出了一個由電解液的歐姆電阻(Rs)、雙層電容(Cd

9、l)、電子轉移電阻(Ret)和Warburg阻抗構成的等效電路模擬免疫傳感器的性能。結果顯示：當目標菌吸附到電極表面時，Ret變化最大。在1.6×103～1.6×106CFU/mL范圍內，阻抗變化值和濃度的對數(shù)值成線性關系：y=244.31 LogN-739.96，決定系數(shù)R2為0.9808。該免疫傳感器的檢測限是103CFU/mL。電化學阻抗譜和循環(huán)伏安曲線可以很好地表征電極表面的修飾及免疫反應的進行。
　　 (6)建立了基于

10、石英晶體金電極的無標記型電容式免疫傳感器用于對大腸桿菌O157：H7的檢測。MPA自組裝膜作為媒介將抗體固定到電極表面。試驗結果顯示：雙層電容的變化和大腸桿菌O157：H7的濃度相關；在102～105CFU/mL范圍時，雙層電容在1 Hz的變化值和濃度的對數(shù)值呈線性關系，回歸方程：y=-41.65 LogN+56.75，決定系數(shù)R2為0.98；等效電路中，雙層電容(Cdl)由Cins、Crec、CGC串聯(lián)構成；該電容式免疫傳感器在一個小