滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)ECTOINE對(duì)酶穩(wěn)定性影響的研究.pdf

1、環(huán)形氨基酸Ectoine(1，4，5，6—四氫—2—甲基—4—嘧啶羧酸)是由嗜鹽菌在高滲透壓誘導(dǎo)下合成的一種具有兩性離子特性的滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等在逆環(huán)境下具有保護(hù)作用。本論文以植酸酶和脂肪酶為酶蛋白，從發(fā)酵制備、對(duì)酶的保護(hù)應(yīng)用和作用機(jī)理等方面對(duì)Ectoine進(jìn)行了研究。
　　 從鹽池淤泥中篩選了一株中度嗜鹽菌B2。細(xì)胞抽提物中經(jīng)1H—NMR鑒定含有Ectoine。菌株經(jīng)16S rDNA鑒定屬于鹽單胞菌屬(H

2、alomonas sp．)。在含2 mol/L NaCl的谷氨酸單鈉培養(yǎng)基中發(fā)酵合成Ectoine最大量達(dá)到3．5g/。
　　 通過與其他補(bǔ)償性溶質(zhì)比較，考察了Ectoine對(duì)植酸酶(PHYAⅡ)的熱穩(wěn)定性保護(hù)作用。研究了Ectoine的添加量、保護(hù)方式及對(duì)PHYAⅡ高溫水解的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ectoine作為PHYAⅡ的熱穩(wěn)定性保護(hù)劑，用量最少，保護(hù)作用好。
　　 利用PHYAⅡ失活熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)合紫外和熒

3、光光譜技術(shù)，推測(cè)Ectoine提高了酶熱穩(wěn)定性的作用機(jī)理。結(jié)果表明，Ectoine可以提高酶分子△U*、△H*、△G*和t1/2，降低失活速率常數(shù)k；熒光、紫外吸收光譜表明Ectoine對(duì)酶熱處理后的肽鏈伸展不利。因此推測(cè)Ectoine的添加主要導(dǎo)致酶內(nèi)部或酶與外界水介質(zhì)的氫鍵發(fā)生變化，從而有利于酶熱穩(wěn)定性增加。
　　 以轉(zhuǎn)酯合成生物柴油和酯化合成油酸乙酯為反應(yīng)體系，考察Ectoine對(duì)Novozym435和Aspergillu

4、s oryzae DM—01全細(xì)胞脂肪酶在有機(jī)相中酶活性的影響。結(jié)果表明，作為底物的甲醇和乙醇在一定濃度下對(duì)脂肪酶具有抑制作用。添加適量Ectoine，在脂肪酶一次或反復(fù)使用中，均對(duì)脂肪酶有顯著保護(hù)作用。和同質(zhì)量的其他補(bǔ)償性溶質(zhì)比較，Ectoine保護(hù)效果最好。添加過量Ectoine則會(huì)抑制酶活性。
　　 利用傅立葉變換紅外光譜技術(shù)(FTIR)，結(jié)合酶催化動(dòng)力學(xué)分析，探討Ectoine提高脂肪酶在甲(乙)醇和油酸中活性的保護(hù)機(jī)理