核酸及小分子物質(zhì)的液晶生物傳感檢測方法研究.pdf

1、液晶(LiquidCrystal,LC)是介于固體和液體之間的一種特殊物質(zhì)形態(tài),由于具有獨特的物理化學(xué)特性,近年來被作為敏感元件構(gòu)建液晶生物傳感器。液晶生物傳感器的檢測原理是建立在液晶具有雙折射特性基礎(chǔ)上,根據(jù)傳感界面接觸目標(biāo)物前后,液晶分子在基底表面的取向排列發(fā)生變化,改變對光線的折射能力,導(dǎo)致光學(xué)圖像信號的顏色和亮度發(fā)生變化,實現(xiàn)對目標(biāo)分子的檢測。相對于其它類型的檢測技術(shù),該傳感器具有構(gòu)造簡單,低耗,易于實現(xiàn)微型化和陣列化等優(yōu)點。目

2、前液晶生物傳感器主要用于分析監(jiān)測蛋白質(zhì)、大分子抗原-抗體、核酸等生物分子的相互作用,在小分子物質(zhì)及金屬離子的檢測領(lǐng)域研究甚少。此外,已報道的液晶生物傳感器靈敏度普遍偏低,難以滿足現(xiàn)代分析檢測的要求,因此擴(kuò)展液晶生物傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域,研發(fā)更靈敏、準(zhǔn)確的新型液晶生物傳感檢測技術(shù)已成為新的研究方向。建立高性能液晶生物傳感器的關(guān)鍵問題主要在于:構(gòu)建良好的傳感基底敏感膜,建立對目標(biāo)分子的有效識別措施以及對識別事件的靈敏信號轉(zhuǎn)換和信號增強。本文圍繞

3、這些問題,在提高液晶生物傳感檢測方法靈敏度和實現(xiàn)液晶生物傳感對小分子物質(zhì)靈敏檢測等方面進(jìn)行了初步探討,主要研究內(nèi)容如下:
　　(1)基于AuNPs具有比表面積大、生物相容性好及表面負(fù)載量高的優(yōu)良性能,將功能化的AuNPs作為信號放大手段與液晶生物傳感技術(shù)相結(jié)合,提出了一種基于納米金信號增強的高靈敏DNA液晶生物傳感檢測方法。首先采用N,N-二甲基-N-十八烷基-3-氨丙基三甲氧基甲硅烷基氯化銨(DMOAP)和3-氨丙基三甲氧基硅烷

4、(APS)兩種硅烷化試劑混合組裝基底表面,提供無干擾背景和便于固定生物分子的敏感膜,然后在其表面固定捕獲探針,當(dāng)目標(biāo)DNA分子存在時,一端可與捕獲探針進(jìn)行雜交,另一端則與納米金標(biāo)記的信號探針(DNA-AuNPs)雜交,將DNA-AuNPs結(jié)合于傳感基底表面。由于納米金表面可以固定大量信號探針,因此DNA-AuNPs的引入顯著改變基底表面形貌,增強對液晶分子取向排列的影響,從而增強檢測信號,提高靈敏度。該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確,可獲得0.1

5、pM的檢出限。
　　(2)以K-ras基因第12位密碼子點突變(GGT突變?yōu)镚TT)為模型,建立了基于滾環(huán)擴(kuò)增信號放大的液晶生物傳感方法檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)。首先采用三乙氧基丁醛硅烷(TEA)和DMOAP混合修飾傳感基底表面構(gòu)建敏感膜,然后在其表面組裝捕獲探針,通過雜交反應(yīng)將滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合于傳感基底表面。當(dāng)目標(biāo)物存在時,滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物為一條長度可達(dá)幾萬個堿基,且具有大量重復(fù)序列的單鏈DNA,結(jié)合于傳感基底表面能顯著改變基底

6、的表面形貌,擾亂液晶分子的有序排列,進(jìn)而產(chǎn)生明顯可辨的圖像變化,達(dá)到檢測目標(biāo)物的目的。
　　(3)由于低濃度的重金屬離子對液晶的作用力非常弱,不足以擾亂液晶分子的垂直排列,因此研究檢測重金屬離子的液晶生物傳感方法非常少。為了拓展液晶生物傳感檢測技術(shù)在重金屬離子領(lǐng)域的應(yīng)用,本章以汞離子為代表建立了一種靈敏度高,特異性好的非標(biāo)記液晶生物傳感方法檢測重金屬離子。該方法基于雙鏈DNA能有效擾亂液晶分子的有序排列,及功能核酸對金屬離子的高親

7、和力和高度特異性的結(jié)合原理,采用目標(biāo)物誘導(dǎo)核酸分子構(gòu)象發(fā)生變化增強對液晶分子有序排列的擾亂,達(dá)到信號放大的目的。當(dāng)Hg2+存在時,基于“T-Hg2+-T”特異性結(jié)合作用,促使Hg2+特異核酸探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,打開的發(fā)夾型探針3′末端可與基底的捕獲探針進(jìn)行雜交反應(yīng),從而將雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA引入傳感基底表面,雙鏈DNA能夠顯著擾亂液晶分子的有序排列,導(dǎo)致信號增強。該方法將對重金屬離子的檢測轉(zhuǎn)換成對DNA分子雜交反應(yīng)事件的檢測,大大提高了對重

8、金屬離子的檢測靈敏度,檢出限可達(dá)0.1nM。
　　(4)構(gòu)建了基于裂開型核酸適體的非標(biāo)記液晶生物傳感方法檢測三磷酸腺苷(ATP)。將ATP核酸適體分為兩部分,其中一部分序列作為捕獲探針固定在經(jīng)TEA/DMOAP混合修飾的傳感基底表面,當(dāng)ATP存在時,裂開的兩部分核酸適體在ATP的介導(dǎo)下形成雙鏈結(jié)構(gòu),進(jìn)而有效誘導(dǎo)液晶分子排列取向發(fā)生變化,引起光學(xué)信號的亮度及顏色發(fā)生變化,實現(xiàn)對ATP的檢測,該方法在ATP的濃度為10nM時仍可觀測到

9、明顯的光學(xué)信號變化。這種基于“適配體-目標(biāo)分子-適配體”的“三明治”夾心式液晶生物傳感方法具有無需標(biāo)記,操作簡單等特點,為建立小分子液晶生物傳感檢測方法提供了新思路。
　　(5)根據(jù)競爭免疫反應(yīng)的原理,以吲哚乙酸(IAA)小分子抗原為模型,研究了一種非標(biāo)記、快速檢測小分子抗原的新型液晶免疫傳感方法。由于IAA為小分子抗原,分子尺寸效應(yīng)小,對液晶分子作用力也非常小,因此對液晶分子的排列取向影響極小,而其抗體分子屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì),分子