磷酸酶與生物小分子檢測的非標(biāo)記熒光傳感新方法研究.pdf

1、堿性磷酸酶(ALP)是一種能夠從多種生物分子如核酸，蛋白質(zhì)，生物堿等中去除其磷酸基團的水解酶。ALP的催化反應(yīng)能將DNA末端的磷酸基團修復(fù)成羥基。ALP在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝以及神經(jīng)元作用等許多生物進程中扮演了重要的作用。三磷酸腺苷(ATP)是生物體中的重要基質(zhì)，是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動所需能量的直接來源，被譽為細(xì)胞內(nèi)能量的“分子貨幣”。ATP在細(xì)胞新陳代謝和生化過程的調(diào)控中扮演了重要的角色。因此，研究高靈敏和高選擇性的ALP和ATP的

2、檢測方法對于生化分析和臨床診斷非常重要。
　　 非標(biāo)記檢測法由于具有快速簡便成本低的特點而備受關(guān)注。SYBR GreenⅠ(SG)是最常用的一種DNA嵌入染料，具有良好的光物理性質(zhì)、熱穩(wěn)定性以及高靈敏度，被廣泛用于分子檢測。但該方法存在非特異性吸附導(dǎo)致的高背景的缺陷，因而降低了信背比和靈敏度。
　　 目前，基于氧化石墨烯(GO)的傳感平臺已經(jīng)廣泛應(yīng)用于一系列的分析物檢測。這歸因于GO獨特的吸附DNA以及很強的淬滅熒光的能

3、力。有關(guān)文獻報道了GO作為有效的信背比增強劑用于非標(biāo)記分析檢測中。
　　 綜上所述，在查閱已有的文獻基礎(chǔ)上，本文構(gòu)建了一系列新型的非標(biāo)記熒光生物傳感器用于檢測磷酸酶和生物小分子。具體的工作內(nèi)容如下:
　　 在第二章中，發(fā)展了一種非標(biāo)記、簡單、信號增強型，利用SYBR GreenⅠ(SG)輔助信號放大的熒光生物傳感器用于檢測堿性磷酸酶(ALP)。該策略基于ALP將磷酸化的DNA去磷酸化為羥基從而阻礙λ外切酶（λexo）的作

4、用，熒光染料SG與單鏈DNA(ssDNA)和雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合作用的差異的原理，實現(xiàn)熒光檢測。我們的方法簡單、靈敏度高、選擇性好，并且能夠成功地用于分析復(fù)雜生物樣本中的目標(biāo)物。分析結(jié)果表明該方法可以對目標(biāo)物ALP進行特異性定量分析，線性范圍是0.4-200 U/mL，檢測限是0.05 U/mL。
　　 在第三章中，發(fā)展了一種基于發(fā)夾引物和聚合酶延伸的氧化石墨烯(GO)傳感新平臺檢測DNA3'磷酸酶。我們設(shè)計了一條3'磷

5、酸化的發(fā)夾引物(HP)作為DNA3'磷酸酶的底物鏈。當(dāng)DNA3'磷酸酶將磷酸基團水解為羥基，去磷酸化的HP在Klenow片段聚合酶(KF polymerase)的作用下發(fā)生聚合延伸，形成很長的雙鏈產(chǎn)物。熒光染料SG會選擇性嵌入雙鏈DNA中，產(chǎn)生很強的熒光。此外，GO對沒有發(fā)生聚合延伸的HP的熒光有很強的淬滅作用，因此可以進一步提升信背比。此設(shè)計方法簡單便捷的同時具有很高的靈敏度以及很好的選擇性。該方法成功用于檢測兩種DNA3'磷酸酶—T

6、4多核苷酸磷酸酶(PNKP)和小蝦堿性磷酸酶(SAP)的活性。我們還研究了抑制劑對這兩種酶的抑制作用。分析結(jié)果表明該方法可以對T4 PNKP和SAP進行高靈敏定量分析，檢測限分別是0.07 U/mL和0.003 U/mL，為應(yīng)用到DNA損傷修復(fù)機制的研究提供了可觀的前景。
　　 在第四章中，發(fā)展了一種基于連接反應(yīng)和氧化石墨烯與ExoⅢ輔助的，SG作為熒光輸出信號的非標(biāo)記熒光分析方法來檢測ATP。該方法依據(jù)核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)