小分子和多聚核苷酸激酶檢測(cè)的熒光傳感新方法研究.pdf

1、T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是一種多聚核苷酸5'羥基激酶，能夠催化ATP的γ位磷酸基團(tuán)向單鏈或者雙鏈 DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團(tuán)的單核苷酸的5'羥基轉(zhuǎn)移。細(xì)胞內(nèi)異常的T4 PNK激酶活性與沃納綜合征，布倫氏癥候群，色素沉著綜合征等疾病息息相關(guān)。三磷酸腺苷(ATP)是所有細(xì)胞生命活動(dòng)的直接供能物質(zhì)，有“分子貨幣”的美譽(yù)。ATP參與蛋白質(zhì)，糖，核酸，脂肪等的合成過(guò)程。人體內(nèi)非正常的ATP水平將會(huì)導(dǎo)致心腦血管疾病，阿爾茲

2、海默癥，帕金森癥等。因此研究高靈敏，高選擇性的T4PNK和ATP檢測(cè)方法對(duì)生化研究和臨床診斷具有重要意義。熒光生物傳感技術(shù)是基于熒光信號(hào)變化的檢測(cè)方法。通常的熒光信號(hào)變化包括熒光淬滅，熒光增強(qiáng)以及熒光發(fā)射波長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移。熒光生物傳感技術(shù)具有靈敏度高、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于生物小分子、蛋白質(zhì)、酶活性、核酸等的檢測(cè)。氧化石墨烯(GO)是一種新型的碳納米材料。近年來(lái)由于其獨(dú)特的光電性質(zhì)和良好的生物相容性受到研究者廣泛的關(guān)注。GO作為多種熒光

3、染料的通用型猝滅劑能高效的吸附單鏈DNA，而對(duì)DNA碎片吸附能力較弱。細(xì)胞色素C(Cyt c)是一種血紅素蛋白，其等電點(diǎn)(pI)為10.0-10.5。在弱堿性溶液中可以通過(guò)靜電吸附、疏水作用吸附單鏈或雙鏈 DNA，并通過(guò)電子轉(zhuǎn)移將標(biāo)記于DNA鏈的熒光染料的熒光淬滅，但Cyt c對(duì)DNA碎片吸附能力較弱。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴構(gòu)造了一種ExoⅢ輔助的基于GO的熒光放大分析傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的檢測(cè)。本傳感器依據(jù)ATP與其適配體高

4、特異性識(shí)別綁定、ExoⅢ對(duì)不同的底物具有不同的切割性能以及GO對(duì)單鏈DNA與核酸碎片吸附能力的差異設(shè)計(jì)而成。本傳感器對(duì)ATP的檢測(cè)下線達(dá)到0.1μM，并在0-200μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。該傳感器在人血清中同樣具有較好的分析性能。⑵基于Cyt c熒光淬滅作用以及對(duì)雙鏈DNA和DNA碎片吸附能力的差異發(fā)展了一種新穎、簡(jiǎn)單的T4 PNK傳感方法。當(dāng)只有λ Exo作用時(shí)，加入Cyt c后 dsDNA-FAM的熒光淬滅。這是因?yàn)镃yt

5、c可以有效地吸附雙鏈 DNA，并通過(guò)電子轉(zhuǎn)移淬滅染料的熒光。當(dāng)T4 PNK和λExo同時(shí)作用時(shí)，dsDNA-FAM首先被磷酸化隨后被水解成核酸碎片。加入Cyt c后FAM熒光不被淬滅。我們通過(guò)測(cè)定熒光響應(yīng)信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)T4PNK的定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，我們構(gòu)建分析方法具有良好的選擇性、穩(wěn)定性。⑶設(shè)計(jì)了基于λ核酸外切酶(λExo)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的熒光信號(hào)放大方法用于T4 PNK激酶活性和激酶抑制劑的檢測(cè)。在檢測(cè)分析中，T4 PN