小球藻類金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)表征及抗氧化與抗菌活性研究.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一類低分子量、高巰基含量，且能大量結(jié)合重金屬離子的蛋白質(zhì)。MTs具有抗氧化、抗腫瘤、解毒及免疫調(diào)節(jié)等生理功能。因此，尋找開發(fā)MTs的資源引起了科學(xué)家的興趣。研究發(fā)現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)存在類金屬硫蛋白，且含量可隨重金屬誘導(dǎo)明顯提高?；诖耍疚耐ㄟ^鋅誘導(dǎo)小球藻，對(duì)小球藻細(xì)胞內(nèi)的類金屬硫蛋白進(jìn)行提取分離和結(jié)構(gòu)表征研究，并且對(duì)小球藻類金屬硫蛋白的抗氧化及抗菌活性等功能進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 本

2、學(xué)位論文由六章組成。第一章，較系統(tǒng)地介紹了金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)、生理功能與檢測(cè)方法，對(duì)小球藻的生理活性物質(zhì)提取、開發(fā)及應(yīng)用情況進(jìn)行總結(jié)。
　　 第二章，在優(yōu)化小球藻培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，考察重金屬對(duì)小球藻生物量及金屬結(jié)合蛋白誘導(dǎo)量的影響。經(jīng)優(yōu)化，小球藻的培養(yǎng)液組成為：以滅菌海水為基礎(chǔ)，加入1.0 g/LNHCO3、0.8 g/L KNO3、0.02g/L KH2PO4、0.6 mg/L VB1和2μg/L VB12。此時(shí)，小球藻的生物量

3、可達(dá)4×107 cfu/mL。待小球藻培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，分別加入5、10、20、40、60和80μmol/L的重金屬(CdCl2、ZnCl2、CuSO4·5H2O)進(jìn)行脅迫培養(yǎng)，考察重金屬對(duì)小球藻生物量和金屬結(jié)合蛋白誘導(dǎo)量的影響。結(jié)果表明，在低濃度條件下，小球藻生物量和金屬結(jié)合蛋白誘導(dǎo)量均隨重金屬離子(Cd2+、Zn2+、Cu2+)濃度的升高而增加，當(dāng)Cd2+、Zn2+和Cu2+的濃度分別為40μmol/L、20μmol/L和5μm

4、ol/L時(shí)，生物量達(dá)到最大；當(dāng)Cd2+、Zn2+和Cu2+的濃度分別為60μmol/L、60μmol/L和40μmol/L時(shí)，金屬結(jié)合蛋白誘導(dǎo)量達(dá)到最大。
　　 第三章，小球藻經(jīng)60μmol/L的Zn2+脅迫培養(yǎng)5天，然后離心收集藻泥，經(jīng)超聲波細(xì)胞破碎后，離心得到上清液即蛋白質(zhì)粗提液。粗提液經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱G-75及脫鹽柱G-25分離、純化，經(jīng)真空冷凍干燥即獲得小球藻鋅結(jié)合蛋白。經(jīng)分析，未脫鹽的小球藻鋅結(jié)合蛋白的純度為62.4

5、%，脫鹽后純度為99.5%。試驗(yàn)測(cè)定了小球藻鋅結(jié)合蛋白在不同pH值下的紫外吸收光譜。結(jié)果表明，小球藻鋅結(jié)合蛋白的紫外光譜特征與兔肝金屬硫蛋白(Zn-MTs)的十分相似，故將其命名為類金屬硫蛋白(Zn-MT-like)。此外，用Tricine-SDS-PAGE法測(cè)定該蛋白質(zhì)的分子量約為8.2 kDa。經(jīng)測(cè)算，每克鮮藻可誘導(dǎo)Zn-MT-like蛋白達(dá)2 mg以上。
　　 第四章，用不同方法對(duì)小球藻類金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征研究。DE

6、AE SephadexA-25的陰離子交換層析分離的結(jié)果表明，小球藻類金屬硫蛋白出現(xiàn)兩個(gè)鋅信號(hào)峰，其中第二個(gè)峰與兔肝MTs-2的洗脫時(shí)間相同，而第一個(gè)峰稍前于MTs-1被洗脫。在pH2.0時(shí)，經(jīng)C18反相柱(2.1 i.d.×250 mm，5μm)分離并與電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有三個(gè)強(qiáng)的信號(hào)峰，經(jīng)推算這三個(gè)色譜峰組分的分子量分別為6222.3 Da、6162.5 Da和6132.2 Da。從氨基酸組成的分析結(jié)果可知，小球藻Z

7、n-MT-like蛋白由78個(gè)氨基酸組成，其中半胱氨酸含量可達(dá)15.4%，并含有苯丙氨酸等芳香族氨基酸和組氨酸。此外，經(jīng)電感耦合等離子質(zhì)譜測(cè)得每分子Zn-MT-like蛋白可結(jié)合2個(gè)鋅離子。
　　 第五章，對(duì)小球藻類金屬硫蛋白的抗氧化及抗菌活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，小球藻Zn-MT-like蛋白清除羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的半數(shù)抑制率濃度(IC50)分別為13.12 mg/L、2.23 mg/L和48.59 mg

8、7L，其清除能力高于兔肝Zn-MTs和谷胱苷肽。采用瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法，對(duì)小球藻Zn-MT-like蛋白的抗菌活性進(jìn)行試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)小球藻Zn-MT-like蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌)和霉菌(青霉、曲霉)具有顯著的抗菌活性，1 mg/mL的Zn-MT-like蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、青霉和曲霉的抑菌圈直徑分別為13.2 mm、17.4 mm、7.2 mm和9.8 mm，而對(duì)大腸桿菌、酵母菌則無(wú)抗菌活性。