有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向神經(jīng)營養(yǎng)因子-3應(yīng)用于脊髓損傷修復(fù)的可行性研究.pdf

1、研究背景：
　　 脊髓損傷(spain cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類嚴重創(chuàng)傷,據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：2006年全世界脊髓損傷的患病率為(233—755)/百萬。而中國每年則約有八萬左右的新患者，多由于車禍及墜落傷等因為造成的脊柱骨折、脫位所致,常遺留嚴重的傷殘。脊髓損傷所造成的運動及感覺功能障礙,明顯降低了患者的生存和生活質(zhì)量。而傳統(tǒng)的治療方法僅限于脊柱骨折脫位的整復(fù)、固定、解除脊髓壓迫及康復(fù)治療等,但其治療療

2、效欠佳。雖然在過去二十年里,世界各國研究者為此做出了巨大努力,卻并沒有獲得顯著的功能恢復(fù)。SCI的治療仍然是一個世界性的醫(yī)學難題。
　　 眾所周知,脊髓損傷常常造成一系列病理改變，如機械力直接導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡；與高位中樞連續(xù)性中斷；損傷節(jié)段以遠突起遭受沃勒變性；脊髓斷端新的神經(jīng)膠質(zhì)界膜形成并回縮以及二次損傷增加原發(fā)損傷面積等等。而在人類脊髓損傷病例中,損傷長度可能達到1cm,甚至更廣泛。然而傷后神經(jīng)再生過程相當復(fù)雜,盡管會出現(xiàn)

3、內(nèi)生性重建:如軸突出芽生長、炎癥細胞、內(nèi)皮細胞以及雪旺細胞侵入損傷區(qū)域等。但是僅僅依靠這些內(nèi)在的修復(fù)進行重建所取得的功能提高非常有限。過去多年的研究表明造成軸突再生受限的因為至少包含以下幾點:1,缺乏支持軸突延長通過損傷區(qū)域的基質(zhì)；2,缺乏必要的神經(jīng)營養(yǎng)支持；3,損傷區(qū)域的髓鞘及細胞抑制因子的存在；4,成熟神經(jīng)元再生能力有限；5,炎性反應(yīng)造成的更嚴重的二次損傷；而慢性損傷存在更多的障礙,如損傷區(qū)域周圍膠質(zhì)疤痕的形成；遭受慢性損傷的神經(jīng)元

4、對再生相關(guān)基因的敏感程度下降，甚至萎縮等。
　　 近20年廣大研究者針對影響神經(jīng)損傷再生的各種因素,做了許多嘗試,如提高損傷后神經(jīng)元的存活、抑制損傷后膠質(zhì)疤痕生長、種子細胞或支架移植以及促再生因子的應(yīng)用等等,都取得了一定的修復(fù)效果。隨后,越來越多的研究表明聯(lián)合治療策略較單一治療策略應(yīng)用于脊髓損傷修復(fù)更有效。如分解硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)分子糖鏈的軟骨素酶ABC(ChABC)與承載有雪旺細胞的支架的應(yīng)用能促進軸突再生通過移植

5、物-宿主界面；浸有神經(jīng)營養(yǎng)因子的雪旺細胞支架提高再生軸突進入支架內(nèi)部；神經(jīng)營養(yǎng)因子3與環(huán)磷酸腺苷的聯(lián)合應(yīng)用促軸突再生通過損傷區(qū)；神經(jīng)干細胞與過表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的雪旺細胞聯(lián)合移植促進損傷后脊髓功能及結(jié)構(gòu)改善等。
　　 神經(jīng)營養(yǎng)因子由于其對神經(jīng)元存活及神經(jīng)突外生起重要作用而備受關(guān)注。其家族成員包括神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derired neurotrophic

6、factor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4/5(Neurotrophin-4/5,NT-4/5)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-6(Neurotrophin-6,NT-6)等。它們?yōu)椴煌瑏喰偷纳窠?jīng)元生長、分化和維系所需要。由于NT3-mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達,且NT3能通過結(jié)合Trk酪氨酸激酶受體C(TrkC)激活下游Rho GTPases家族,作用于細胞中微管及肌動蛋白絲推動突起生長

7、延伸；同時NT3也是調(diào)節(jié)髓鞘形成的重要介質(zhì),可以促進重要的運動通路如皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tracts,CST)的生長等,使其在脊髓損傷修復(fù)研究中顯得尤其重要。但是由于神經(jīng)營養(yǎng)因子價格高昂使其廣泛應(yīng)用受到限制。已有嘗試各種方式將外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子應(yīng)用于脊髓損傷的研究以期克服外源性給藥方式的缺陷,包括:損傷處直接注射、移植微量滲透泵、移植浸潤NT3的膠原基質(zhì)、病毒載體轉(zhuǎn)運NT3等等。然而經(jīng)這樣單一的外源性給藥方式,雖然有

8、一定的促受損神經(jīng)突起再生的作用,但是再生的突起常常是無序隨機生長的,無法達到接近原來脊髓傳導(dǎo)回路,功能提高作用有限。
　　 目前,得益于組織工程學的快速發(fā)展,各種來源的材料如:高分子材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、膠原等被制作成有利于脊髓損傷修復(fù)的支架用于研究,以及將制成的支架聯(lián)合多種策略共同應(yīng)用取得了一定的療效。而膠原材料由于其容易獲取、可塑性強以及良好的生物相容性等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于修復(fù)研究中。
　　 本課題組通

9、過前期對神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)進行改造,構(gòu)建具有膠原結(jié)合區(qū)的NT3(collagen-binding domain neurotrophin-3,CBD-NT3),使其能與膠原特異結(jié)合,并已取得較肯定的效果。本課題通過對有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向神經(jīng)營養(yǎng)因子-3引導(dǎo)細胞突起遷移生長及其生物相容性的研究,證明了這種聯(lián)合策略用于脊髓損傷修復(fù)的可行性。
　　 第一部分有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向NT3引導(dǎo)細胞突起定向生長
　　 目

10、的:研究天然有序膠原材料聯(lián)合有膠原靶向結(jié)合域的NT3對細胞突起延伸的影響,探討這種聯(lián)合策略對脊髓損傷修復(fù)的意義,為進一步聯(lián)合細胞移植治療脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:從SD大鼠尾抽取足夠量肌腱制備膠原支架,盡可能去除黏附組織,并修剪至合適大小的樣本,進一步行去細胞及滅菌處理。利用HE染色評價支架的去細胞處理效果；經(jīng)滅菌后的去細胞支架浸泡負載CBD-NT3后,將其與新生24h的SD大鼠背根節(jié)細胞(Dorsal root gang

11、lion cells,DRGs)體外共培養(yǎng),同時設(shè)NT3、PBS組作為對照。分別在第1、3、5d對支架上細胞行FDA(F1uoresceindiacetate)熒光染色,并測量分析各組細胞突起的延伸長度及角度；在共培養(yǎng)第3d后,利用掃描電鏡觀察共培養(yǎng)后支架和背根節(jié)細胞的超微結(jié)構(gòu),分析支架地貌對細胞形態(tài)及突起延伸的影響。
　　 結(jié)果:HE染色顯示經(jīng)處理后支架內(nèi)細胞成分基本去除,而未經(jīng)處理過的膠原支架內(nèi)部可見較多核染色,同時可見經(jīng)處

12、理后的膠原支架同未經(jīng)處理的膠原材料形態(tài)基本保持一致；共培養(yǎng)第1d三組支架上細胞突起延伸長度無顯著差異(P>0.05),但之后支架上細胞開始貼壁生長延伸,至第3d后CBD—NT3組細胞突起延伸長度最長,其次為NT3組,PBS組最小,CBD—NT3組的細胞突起遷移長度與其他兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但在共培養(yǎng)第5d后CBD—NT3組與NT3組細胞突起延伸長度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),卻仍然較PBS組長(P<0.05)

13、。同時在支架上生長延伸的細胞突起呈現(xiàn)沿支架長軸定向生長的趨勢,而支架以外的細胞突起則呈無序隨機的生長方式；細胞突起延伸角度進一步表明:細胞突起總體延伸方向與膠原支架纖維長軸基本保持平行,夾角<30°。而且突起延伸方向在隨著延伸距離增加時,非但沒有偏離支架纖維長軸,反而有傾向平行的趨勢；掃描電鏡顯示細胞是依靠支架表面地貌錨定和生長的。
　　 結(jié)論:鼠尾肌腱經(jīng)這種去細胞處理方式能達到較好的去細胞效果,而且方便易行,同時仍能保持肌腱原

14、有的縱型膠原纖維結(jié)構(gòu)；具有膠原靶向結(jié)合的NT3聯(lián)合有序膠原支架能發(fā)揮定向引導(dǎo)及更好地促細胞突起延伸的雙重功效,能為脊髓損傷修復(fù)研究提供一種有效的治療途徑。
　　 第二部分膠原支架的細胞相容性及其聯(lián)合膠原靶向NT3體內(nèi)移植的組織相容性
　　 目的:研究經(jīng)處理后的膠原支架對細胞增殖的影響以及其聯(lián)合膠原靶向NT3體內(nèi)移植的組織學反應(yīng),評價這種聯(lián)合策略在體內(nèi)應(yīng)用的可行性。
　　 方法:將經(jīng)去細胞處理支架與骨髓基質(zhì)細胞體外

15、共培養(yǎng),以單獨的骨髓基質(zhì)細胞作為對照組,分別在第1、2、3d,利用CCK-8測量各組細胞增殖情況;將未處理支架、經(jīng)去細胞處理支架以及負載有CBD—NT3、NT3的經(jīng)處理膠原支架分別行Wistar大鼠背部皮下埋植,每只大鼠背部一側(cè)依次按照未處理支架、經(jīng)去細胞處理支架、負載有CBD—NT3的經(jīng)處理膠原支架以及負載有NT3的經(jīng)處理膠原支架的順序進行埋植,兩側(cè)共埋植8處,共6只大鼠,分別在1周和4周后取材,并用HE染色評價大鼠皮下埋植物的組織學

16、反應(yīng)。
　　 結(jié)果:經(jīng)去細胞處理后的支架與骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)共培養(yǎng)的細胞與單獨細胞培養(yǎng)兩組在第1d、2d、3d的OD值均無顯著差異(分別為1d:P=0.520;2d:P=0.601；3d:P=0.810)；皮下埋植的組織學結(jié)果顯示:在第1周和第4周處理支架組支架外周反應(yīng)細胞密度較未處理組少,差異具有統(tǒng)計學意義(1周:P=0.000;4周:P=0.024),而在第1周,兩組間侵入支架內(nèi)部的細胞密度無顯著差異

17、(P=0.067),至第4周時,未處理支架組侵入支架內(nèi)部細胞密度較處理組多,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。對比經(jīng)處理膠原支架聯(lián)合NT3與經(jīng)處理膠原支架聯(lián)合CBD—NT3的組織學反應(yīng)顯示:在第1周及第4周時,無論支架外周反應(yīng)細胞密度或侵入支架內(nèi)部的細胞密度均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:經(jīng)去細胞處理后的膠原支架不影響骨髓基質(zhì)細胞增殖,且體內(nèi)炎癥反應(yīng)較未處理膠原支架輕微；其與CBD—NT3聯(lián)合體內(nèi)埋植實驗證明在