有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3應(yīng)用于脊髓損傷修復(fù)的可行性研究.pdf

1、研究背景：
　　 脊髓損傷(spain cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類嚴(yán)重創(chuàng)傷,據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：2006年全世界脊髓損傷的患病率為(233—755)/百萬(wàn)。而中國(guó)每年則約有八萬(wàn)左右的新患者，多由于車(chē)禍及墜落傷等因?yàn)樵斐傻募怪钦?、脫位所?常遺留嚴(yán)重的傷殘。脊髓損傷所造成的運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)功能障礙,明顯降低了患者的生存和生活質(zhì)量。而傳統(tǒng)的治療方法僅限于脊柱骨折脫位的整復(fù)、固定、解除脊髓壓迫及康復(fù)治療等,但其治療療

2、效欠佳。雖然在過(guò)去二十年里,世界各國(guó)研究者為此做出了巨大努力,卻并沒(méi)有獲得顯著的功能恢復(fù)。SCI的治療仍然是一個(gè)世界性的醫(yī)學(xué)難題。
　　 眾所周知,脊髓損傷常常造成一系列病理改變，如機(jī)械力直接導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡；與高位中樞連續(xù)性中斷；損傷節(jié)段以遠(yuǎn)突起遭受沃勒變性；脊髓斷端新的神經(jīng)膠質(zhì)界膜形成并回縮以及二次損傷增加原發(fā)損傷面積等等。而在人類脊髓損傷病例中,損傷長(zhǎng)度可能達(dá)到1cm,甚至更廣泛。然而傷后神經(jīng)再生過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜,盡管會(huì)出現(xiàn)

3、內(nèi)生性重建:如軸突出芽生長(zhǎng)、炎癥細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及雪旺細(xì)胞侵入損傷區(qū)域等。但是僅僅依靠這些內(nèi)在的修復(fù)進(jìn)行重建所取得的功能提高非常有限。過(guò)去多年的研究表明造成軸突再生受限的因?yàn)橹辽侔韵聨c(diǎn):1,缺乏支持軸突延長(zhǎng)通過(guò)損傷區(qū)域的基質(zhì)；2,缺乏必要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持；3,損傷區(qū)域的髓鞘及細(xì)胞抑制因子的存在；4,成熟神經(jīng)元再生能力有限；5,炎性反應(yīng)造成的更嚴(yán)重的二次損傷；而慢性損傷存在更多的障礙,如損傷區(qū)域周?chē)z質(zhì)疤痕的形成；遭受慢性損傷的神經(jīng)元

4、對(duì)再生相關(guān)基因的敏感程度下降，甚至萎縮等。
　　 近20年廣大研究者針對(duì)影響神經(jīng)損傷再生的各種因素,做了許多嘗試,如提高損傷后神經(jīng)元的存活、抑制損傷后膠質(zhì)疤痕生長(zhǎng)、種子細(xì)胞或支架移植以及促再生因子的應(yīng)用等等,都取得了一定的修復(fù)效果。隨后,越來(lái)越多的研究表明聯(lián)合治療策略較單一治療策略應(yīng)用于脊髓損傷修復(fù)更有效。如分解硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)分子糖鏈的軟骨素酶ABC(ChABC)與承載有雪旺細(xì)胞的支架的應(yīng)用能促進(jìn)軸突再生通過(guò)移植

5、物-宿主界面；浸有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的雪旺細(xì)胞支架提高再生軸突進(jìn)入支架內(nèi)部；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3與環(huán)磷酸腺苷的聯(lián)合應(yīng)用促軸突再生通過(guò)損傷區(qū)；神經(jīng)干細(xì)胞與過(guò)表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的雪旺細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)損傷后脊髓功能及結(jié)構(gòu)改善等。
　　 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子由于其對(duì)神經(jīng)元存活及神經(jīng)突外生起重要作用而備受關(guān)注。其家族成員包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derired neurotrophic

6、factor,BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(Neurotrophin-3,NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4/5(Neurotrophin-4/5,NT-4/5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-6(Neurotrophin-6,NT-6)等。它們?yōu)椴煌瑏喰偷纳窠?jīng)元生長(zhǎng)、分化和維系所需要。由于NT3-mRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá),且NT3能通過(guò)結(jié)合Trk酪氨酸激酶受體C(TrkC)激活下游Rho GTPases家族,作用于細(xì)胞中微管及肌動(dòng)蛋白絲推動(dòng)突起生長(zhǎng)

7、延伸；同時(shí)NT3也是調(diào)節(jié)髓鞘形成的重要介質(zhì),可以促進(jìn)重要的運(yùn)動(dòng)通路如皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tracts,CST)的生長(zhǎng)等,使其在脊髓損傷修復(fù)研究中顯得尤其重要。但是由于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子價(jià)格高昂使其廣泛應(yīng)用受到限制。已有嘗試各種方式將外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子應(yīng)用于脊髓損傷的研究以期克服外源性給藥方式的缺陷,包括:損傷處直接注射、移植微量滲透泵、移植浸潤(rùn)NT3的膠原基質(zhì)、病毒載體轉(zhuǎn)運(yùn)NT3等等。然而經(jīng)這樣單一的外源性給藥方式,雖然有

8、一定的促受損神經(jīng)突起再生的作用,但是再生的突起常常是無(wú)序隨機(jī)生長(zhǎng)的,無(wú)法達(dá)到接近原來(lái)脊髓傳導(dǎo)回路,功能提高作用有限。
　　 目前,得益于組織工程學(xué)的快速發(fā)展,各種來(lái)源的材料如:高分子材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)、膠原等被制作成有利于脊髓損傷修復(fù)的支架用于研究,以及將制成的支架聯(lián)合多種策略共同應(yīng)用取得了一定的療效。而膠原材料由于其容易獲取、可塑性強(qiáng)以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于修復(fù)研究中。
　　 本課題組通

9、過(guò)前期對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT3)進(jìn)行改造,構(gòu)建具有膠原結(jié)合區(qū)的NT3(collagen-binding domain neurotrophin-3,CBD-NT3),使其能與膠原特異結(jié)合,并已取得較肯定的效果。本課題通過(guò)對(duì)有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3引導(dǎo)細(xì)胞突起遷移生長(zhǎng)及其生物相容性的研究,證明了這種聯(lián)合策略用于脊髓損傷修復(fù)的可行性。
　　 第一部分有序膠原支架聯(lián)合膠原靶向NT3引導(dǎo)細(xì)胞突起定向生長(zhǎng)
　　 目

10、的:研究天然有序膠原材料聯(lián)合有膠原靶向結(jié)合域的NT3對(duì)細(xì)胞突起延伸的影響,探討這種聯(lián)合策略對(duì)脊髓損傷修復(fù)的意義,為進(jìn)一步聯(lián)合細(xì)胞移植治療脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:從SD大鼠尾抽取足夠量肌腱制備膠原支架,盡可能去除黏附組織,并修剪至合適大小的樣本,進(jìn)一步行去細(xì)胞及滅菌處理。利用HE染色評(píng)價(jià)支架的去細(xì)胞處理效果；經(jīng)滅菌后的去細(xì)胞支架浸泡負(fù)載CBD-NT3后,將其與新生24h的SD大鼠背根節(jié)細(xì)胞(Dorsal root gang

11、lion cells,DRGs)體外共培養(yǎng),同時(shí)設(shè)NT3、PBS組作為對(duì)照。分別在第1、3、5d對(duì)支架上細(xì)胞行FDA(F1uoresceindiacetate)熒光染色,并測(cè)量分析各組細(xì)胞突起的延伸長(zhǎng)度及角度；在共培養(yǎng)第3d后,利用掃描電鏡觀察共培養(yǎng)后支架和背根節(jié)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),分析支架地貌對(duì)細(xì)胞形態(tài)及突起延伸的影響。
　　 結(jié)果:HE染色顯示經(jīng)處理后支架內(nèi)細(xì)胞成分基本去除,而未經(jīng)處理過(guò)的膠原支架內(nèi)部可見(jiàn)較多核染色,同時(shí)可見(jiàn)經(jīng)處

12、理后的膠原支架同未經(jīng)處理的膠原材料形態(tài)基本保持一致；共培養(yǎng)第1d三組支架上細(xì)胞突起延伸長(zhǎng)度無(wú)顯著差異(P>0.05),但之后支架上細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)延伸,至第3d后CBD—NT3組細(xì)胞突起延伸長(zhǎng)度最長(zhǎng),其次為NT3組,PBS組最小,CBD—NT3組的細(xì)胞突起遷移長(zhǎng)度與其他兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但在共培養(yǎng)第5d后CBD—NT3組與NT3組細(xì)胞突起延伸長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),卻仍然較PBS組長(zhǎng)(P<0.05)

13、。同時(shí)在支架上生長(zhǎng)延伸的細(xì)胞突起呈現(xiàn)沿支架長(zhǎng)軸定向生長(zhǎng)的趨勢(shì),而支架以外的細(xì)胞突起則呈無(wú)序隨機(jī)的生長(zhǎng)方式；細(xì)胞突起延伸角度進(jìn)一步表明:細(xì)胞突起總體延伸方向與膠原支架纖維長(zhǎng)軸基本保持平行,夾角<30°。而且突起延伸方向在隨著延伸距離增加時(shí),非但沒(méi)有偏離支架纖維長(zhǎng)軸,反而有傾向平行的趨勢(shì)；掃描電鏡顯示細(xì)胞是依靠支架表面地貌錨定和生長(zhǎng)的。
　　 結(jié)論:鼠尾肌腱經(jīng)這種去細(xì)胞處理方式能達(dá)到較好的去細(xì)胞效果,而且方便易行,同時(shí)仍能保持肌腱原

14、有的縱型膠原纖維結(jié)構(gòu)；具有膠原靶向結(jié)合的NT3聯(lián)合有序膠原支架能發(fā)揮定向引導(dǎo)及更好地促細(xì)胞突起延伸的雙重功效,能為脊髓損傷修復(fù)研究提供一種有效的治療途徑。
　　 第二部分膠原支架的細(xì)胞相容性及其聯(lián)合膠原靶向NT3體內(nèi)移植的組織相容性
　　 目的:研究經(jīng)處理后的膠原支架對(duì)細(xì)胞增殖的影響以及其聯(lián)合膠原靶向NT3體內(nèi)移植的組織學(xué)反應(yīng),評(píng)價(jià)這種聯(lián)合策略在體內(nèi)應(yīng)用的可行性。
　　 方法:將經(jīng)去細(xì)胞處理支架與骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外

15、共培養(yǎng),以單獨(dú)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為對(duì)照組,分別在第1、2、3d,利用CCK-8測(cè)量各組細(xì)胞增殖情況;將未處理支架、經(jīng)去細(xì)胞處理支架以及負(fù)載有CBD—NT3、NT3的經(jīng)處理膠原支架分別行Wistar大鼠背部皮下埋植,每只大鼠背部一側(cè)依次按照未處理支架、經(jīng)去細(xì)胞處理支架、負(fù)載有CBD—NT3的經(jīng)處理膠原支架以及負(fù)載有NT3的經(jīng)處理膠原支架的順序進(jìn)行埋植,兩側(cè)共埋植8處,共6只大鼠,分別在1周和4周后取材,并用HE染色評(píng)價(jià)大鼠皮下埋植物的組織學(xué)

16、反應(yīng)。
　　 結(jié)果:經(jīng)去細(xì)胞處理后的支架與骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),經(jīng)共培養(yǎng)的細(xì)胞與單獨(dú)細(xì)胞培養(yǎng)兩組在第1d、2d、3d的OD值均無(wú)顯著差異(分別為1d:P=0.520;2d:P=0.601；3d:P=0.810)；皮下埋植的組織學(xué)結(jié)果顯示:在第1周和第4周處理支架組支架外周反應(yīng)細(xì)胞密度較未處理組少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1周:P=0.000;4周:P=0.024),而在第1周,兩組間侵入支架內(nèi)部的細(xì)胞密度無(wú)顯著差異

17、(P=0.067),至第4周時(shí),未處理支架組侵入支架內(nèi)部細(xì)胞密度較處理組多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。對(duì)比經(jīng)處理膠原支架聯(lián)合NT3與經(jīng)處理膠原支架聯(lián)合CBD—NT3的組織學(xué)反應(yīng)顯示:在第1周及第4周時(shí),無(wú)論支架外周反應(yīng)細(xì)胞密度或侵入支架內(nèi)部的細(xì)胞密度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:經(jīng)去細(xì)胞處理后的膠原支架不影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖,且體內(nèi)炎癥反應(yīng)較未處理膠原支架輕微；其與CBD—NT3聯(lián)合體內(nèi)埋植實(shí)驗(yàn)證明在