新型納米金膠和DNA酶的傳感技術(shù)對核酸和蛋白檢測的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著人類基因組計劃(HGP)的順利完成和后基因組時代的到來，基因診斷已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)研究的重要領(lǐng)域。脫氧核糖核酸(DNA)是生命體內(nèi)的基因物質(zhì)，具有傳遞遺傳信息等功能，若在結(jié)構(gòu)上稍有變動、差錯、缺失或增多，就可能會導(dǎo)致遺傳性狀的改變或各種疾病的出現(xiàn)，因此對DNA的分析檢測有助于生命科學(xué)的研究、生命活動和信息傳遞規(guī)律的調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)是一類重要的生物標(biāo)志物，它的分析檢測在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有非常重要的意義。如果基因突變在外顯

2、引起有功能意義的突變，會導(dǎo)致所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)生改變，從而影響人類的生命活動，導(dǎo)致基因疾病的產(chǎn)生。生命科學(xué)的飛速發(fā)展對基因和蛋白的檢測提出越來越高的要求，開發(fā)出更靈敏，穩(wěn)定和簡便的生物檢測技術(shù)是目前生命科學(xué)研究的熱點所在。而新興發(fā)展的以Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對原則為基礎(chǔ)的DNA生物傳感器為分子生物學(xué)研究提供了全新的基因檢測技術(shù)，受到生物分析工作者的高度重視。
　　 分子信標(biāo)的提出正是建立在DNA堿基

3、互補(bǔ)配原則的基礎(chǔ)上，以其獨特的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，在選擇性、靈敏度和特異性方面更加優(yōu)于普通的直鏈探針，因此其在基因檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。迄今為止，經(jīng)過研究者們不斷地改進(jìn)，分子信標(biāo)的功能更是得到了快速的發(fā)展，在PCR實時監(jiān)控、基因突變快速分析、活體細(xì)胞動態(tài)分析及DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究等各種領(lǐng)域中開辟了新的途徑。
　　 納米技術(shù)的出現(xiàn)為生物傳感器的發(fā)展提供了無窮想象的空間，基于納米金膠的比色傳感技術(shù)以其方便、快速和肉眼可見的優(yōu)勢在D

4、NA生物傳感器中得到了廣泛的應(yīng)用。納米金膠的良好的生物相容性、簡單的合成條件、大的比表面積、低廉的成本以及所具有的特殊的光學(xué)性質(zhì)為比色技術(shù)的發(fā)展注入了強(qiáng)大的生命力，提高了比色檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。
　　 隨著核酸研究的深入和體外篩選技術(shù)(SELEX)的建立，核酸適體技術(shù)使抗原抗體的反應(yīng)發(fā)生了新的革命性變化，在蛋白組學(xué)到來的時代以其眾多的優(yōu)越性彌補(bǔ)并逐漸替代抗體在蛋白檢測中的應(yīng)用。電化學(xué)核酸適體傳感器結(jié)合了電化學(xué)高靈敏度、輕巧便宜

5、、攜帶方便、耗能少、易微型化等優(yōu)勢和核酸適體對蛋白的高結(jié)合力和特異性更是成為當(dāng)今生物學(xué)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題和方向。
　　 G-四分體結(jié)構(gòu)的DNA酶也是基于核酸適體-配體的思想通過SELEX技術(shù)篩選出來的一種新型的DNA酶。它是一類卟啉鐵與其適體構(gòu)成的具有G-四分體結(jié)構(gòu)的仿辣根過氧化酶的配合物，適體為一段富含G堿基的寡聚核苷酸序列。自1998年，Sen小組提出這類DNA酶以來，它高靈敏的催化性質(zhì)、易于構(gòu)建、易于合成的優(yōu)點，在比色和

6、電致發(fā)光中得到了極大的發(fā)展。
　　 本文的創(chuàng)新之處就是利用了納米金膠，DNA酶等簡單易操作，并且廉價的的各種技術(shù)結(jié)合，建立多種檢測核酸和蛋白的傳感器，發(fā)展了新的基因診斷技術(shù)手段。論文主要內(nèi)容如下：
　　 第一章緒論
　　 SELEX技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了核酸適體的發(fā)展，這其中也包括G-四分體結(jié)構(gòu)的DNA酶發(fā)展。本章首先介紹了DNA生物傳感器尤其是電化學(xué)核酸適體傳感器、分子信標(biāo)技術(shù)及納米金膠在比色檢測中的分類和應(yīng)用，著重

7、介紹了分子信標(biāo)技術(shù)，DNA酶等的發(fā)展及應(yīng)用，闡明了本論文研究的理論基礎(chǔ)和選題依據(jù)。最后提出本論文的目的意義及創(chuàng)新之處。
　　 第二章分子信標(biāo)標(biāo)記的納米金膠比色探針對寡聚核苷酸序列單堿基多態(tài)性的識別
　　 分子信標(biāo)(MB)是一種相比于普通直鏈探針更靈敏地能檢測單堿基錯配的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，因此廣泛被應(yīng)用在各種基因突變的檢測上。本文介紹了一種利用分子信標(biāo)高靈敏、高特異性識別力和納米金凝聚變色的光學(xué)特性，設(shè)計的新型的識別單堿基多

8、態(tài)性的比色檢測方法。利用納米金膠的自組裝技術(shù)將巰基修飾的分子信標(biāo)探針固定到金膠表面制得新型納米金膠探針(AuNPs-MB)，當(dāng)加入不同的目標(biāo)序列(完全互補(bǔ)序列或單堿基錯配序列)與之雜交時，使金膠表面構(gòu)象改變及引起金膠體系熵焓的差異性：即在適當(dāng)鹽度條件下，導(dǎo)致金膠不同程度的聚集，從而實現(xiàn)對單堿基錯配幾率和不同位點的識別。最后，將該比色傳感體系應(yīng)用在對P53基因的檢測上，同樣能夠有效區(qū)分野生型和突變型P53基因，實現(xiàn)對單堿基多態(tài)性的識別。實

9、驗結(jié)果顯示，利用該金膠比色方法，操作簡單，成本低廉，對單堿基錯配在混合目標(biāo)體系中的分辨率能達(dá)到至少5％。
　　 第三章基于G-四分體結(jié)構(gòu)的DNA酶電化學(xué)核酸適體傳感器信號擴(kuò)增檢測凝血酶
　　 本文構(gòu)建了一種結(jié)合核酸適體技術(shù)和DNA酶的特性，以凝血酶蛋白作為研究對象的高效、高靈敏度、特異性識別蛋白質(zhì)的電化學(xué)催化檢測的方法。凝血酶的核酸適體是一段富含G堿基的寡聚核苷酸序列，它被證實能與卟啉鐵配位形成一定的G-四分體結(jié)構(gòu)，當(dāng)其

10、結(jié)合目標(biāo)凝血酶時，該結(jié)構(gòu)就會進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成牢同的DNA酶超分子結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出與辣根過氧化酶相似的催化特性，能對雙氧水進(jìn)行很強(qiáng)的催化氧化，從而應(yīng)用在電化學(xué)上對雙氧水的催化氧化來檢測凝血酶蛋白。該方法通過將DNA酶固定在金電極表面，結(jié)合電化學(xué)的高靈敏度，在有雙氧水存在的情況下，得到催化電流與凝血酶濃度對數(shù)值在1×10-10～1×10-6mol/L范圍內(nèi)線性相關(guān)，檢測限可以達(dá)到6×10-1mol/L,相關(guān)系數(shù)為r=0.994，對凝血酶蛋白的檢測限