灰黃霉素產(chǎn)生菌FS80的誘變選育研究.pdf

1、以灰黃霉素產(chǎn)生菌——(Penicillium patulum)FS80-1為出發(fā)菌株,采用UV-LiCl進(jìn)行復(fù)合誘變,經(jīng)過(guò)三輪選育獲得高產(chǎn)突變株GM120-43,經(jīng)重氮鹽顯色法檢測(cè),其產(chǎn)灰黃霉素能力達(dá)到89496μg/g,與出發(fā)菌株FS80—1相比提高了80.04％,遺傳穩(wěn)定性良好。以UV-LiCl復(fù)合誘變獲得的突變株GM120-43為出發(fā)菌株,采用半導(dǎo)體激光和CO2激光進(jìn)行誘變,分別獲得突變株LD100-1和C1448-1。突變株LD

2、100-1經(jīng)遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)后,產(chǎn)灰黃霉素的效價(jià)達(dá)到119766μg/g,比出發(fā)菌株GM120-43提高了22.58％。由CO2激光誘變獲得的突變株C1448-1經(jīng)遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)后,產(chǎn)灰黃霉素的效價(jià)低于出發(fā)菌株GM120-43。對(duì)突變株LD100-1進(jìn)行固體培養(yǎng)條件研究,結(jié)果表明最佳培養(yǎng)條件如下:碳源基質(zhì)為晚秈米；氮源為NaNO3；培養(yǎng)基固形物的料水比以1:0.75為宜；灰黃霉素合成的前體氯化物以單加NaCl為宜,且Cl-濃度為0.188

3、mol/L是較適宜的；采用液體液體種子液接種,菌齡以44 h,接種量為10％為宜。通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化之后,LD100-1產(chǎn)灰黃霉素效價(jià)達(dá)162233μg/g,比未優(yōu)化之前提高了39.16％。
　　 將出發(fā)菌株FS80-1及突變株GM120-43、LD100-1的大米孢子培養(yǎng)物用無(wú)水乙醇進(jìn)行提取。采用HPLC對(duì)提取液中灰黃霉素含量進(jìn)行檢測(cè),比較HPLC和重氮鹽顯色法兩種檢測(cè)方法的差異性,檢測(cè)結(jié)果表明:菌株FS80-1、GM120-4

4、3和LD100-1產(chǎn)灰黃霉素能力分別為43511μg/g、91858μg/g和105423μg/g,HPLC的檢測(cè)結(jié)果比重氮鹽顯色法檢測(cè)結(jié)果稍微偏低。
　　 提取突變株GM120-43、LD100-1和出發(fā)菌株FS80-1的基因組DNA,并以其基因組DNA為模板,利用18S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增到的18S rDNA測(cè)序并比對(duì),發(fā)現(xiàn)突變株GM120-43和LD100-1兩者之間的序列差異性很小,只是個(gè)別堿基不同,而與FS8

5、0-1相比有多處堿基存在差異,其中有三個(gè)區(qū)域序列差異性較大。
　　 對(duì)出發(fā)菌株FS80-1及突變株GM120-43、LD100-1液體發(fā)酵中裝液量以及α-淀粉酶酶活進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)灰黃霉素產(chǎn)生菌——展青霉對(duì)氧氣的需求量很大,250mL三角瓶裝30 mL的發(fā)酵液為宜。同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),突變株GM120-43在發(fā)酵3 d時(shí),產(chǎn)α-淀粉酶酶活力最高,酶活力可達(dá)到82.3 u/mL。發(fā)酵結(jié)束后,鏡檢發(fā)現(xiàn),相對(duì)出發(fā)菌株FS80-1和突變株L