雷帕霉素產(chǎn)生菌的誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、目的：雷帕霉素（rapamycin，RPM）是一種由三十一元環(huán)組成的三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，見Fig.1，主要由吸水鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生。雷帕霉素最初確定為一種抗真菌抗生素，隨著對此類結(jié)構(gòu)化合物免疫抑制和抗腫瘤作用的深入研究，目前，雷帕霉素已被成功開發(fā)為新型強(qiáng)效的免疫抑制劑，用于器官移植抗排斥反應(yīng)，以及新型包衣涂層藥物，用于涂層支架，防止心臟血管再狹窄。以雷帕霉素為基本結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行其衍生物的藥物合成的研究，使該類藥物在抗腫瘤和基因治療方面展現(xiàn)了

2、更為深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。本文以雷帕霉素產(chǎn)生菌Streptomyces hygroscopicus為研究對象，以提高雷帕霉素的發(fā)酵水平為研究目的，圍繞菌種保藏特點(diǎn)、遺傳育種改造、發(fā)酵條件優(yōu)化進(jìn)行了系列研究。
　　 方法：
　　 1、針對雷帕霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌進(jìn)行菌種保藏方法研究。
　　 2、對出發(fā)菌種進(jìn)行菌種特性考察，研究總結(jié)菌落分化形態(tài)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵統(tǒng)計(jì)，確定優(yōu)勢主型菌落，確定基本的篩選方向。
　　 3、常

3、規(guī)誘變育種通過對UV、N離子注入、激光處理、微波處理、亞硝酸化合物等物理化學(xué)誘變劑進(jìn)行誘變效果比較，確定較佳誘變劑。開展基于核糖體工程改造的氨基糖苷類抗性篩選，耐自身產(chǎn)物突變株選育、耐“毒性”前體突變株選育，嘗試進(jìn)行理性育種的研究。
　　 4、建立吸水鏈霉菌原生質(zhì)體制備及再生體系，進(jìn)行原生質(zhì)體誘變育種。運(yùn)用基因組重排的育種手段，篩選突變菌株。
　　 5、針對雷帕霉素的生物合成途徑，研究發(fā)酵前體物質(zhì)——提供起始單位環(huán)己烷衍

4、生物的前體、羧酸哌啶環(huán)結(jié)構(gòu)的合成前體的作用。
　　 結(jié)果：菌種保藏方法研究，比較了冷干、沙土、液氮三種保藏方法的保藏效果，體現(xiàn)出吸水鏈霉菌對干燥和真空兩種保藏壓力及其敏感，死亡率達(dá)到99.9％以上，經(jīng)典的液氮保藏方法存活率達(dá)到58.2％以上。進(jìn)一步進(jìn)行的超低溫液氮保藏冷凍保護(hù)劑和降溫速率的研究，得到新的冷凍保護(hù)劑海藻糖6％+甘油8％，采用快速冷凍速率，存活率提高到95.6％。
　　 確定具有發(fā)酵優(yōu)勢的主型菌落對出發(fā)菌株N

5、1103進(jìn)行純化分離，進(jìn)而采用變異率較大的UV和亞硝酸鹽復(fù)合誘變，分別篩選出鏈霉素抗性菌株S-6-105，自身抗性突變菌株R-4-271，哌啶酸前體賴氨酸抗性突變株L-5-76，誘變育種發(fā)酵水平提高了50-67％。
　　 原生質(zhì)體技術(shù)的研究，確立了吸水鏈霉菌適宜的菌絲培養(yǎng)工藝，酶解條件，再生條件，成功獲得了原生質(zhì)體再生菌株。進(jìn)一步開展原生質(zhì)體誘變育種，采用激光處理，較孢子敏感度得到顯著提高。以Str-102、R-4-271、L-

6、5-76為出發(fā)菌株嘗試進(jìn)行基因組重排，兩輪效果篩選到具有復(fù)合抗性的變異菌株Y-89。發(fā)酵水平進(jìn)一步提高38％，為原始出發(fā)菌株的2.3倍。
　　 雷帕霉素合成前體的研究，在天然有機(jī)氮源過于豐富的發(fā)酵培養(yǎng)基上，難于體現(xiàn)各可能前體的作用。以硝基氮源替代主要有機(jī)氮源玉米漿，前體作用得到初步體現(xiàn)。莽草酸作為提供環(huán)己烷衍生物的前體，作用顯著，最高消前加入耐受量為0.2％，同時在發(fā)酵過程分批補(bǔ)加羧酸哌啶的合成前體賴氨酸，使發(fā)酵水平進(jìn)一步提高3

7、3％。新菌株新發(fā)酵水平達(dá)到原始出發(fā)水平的3倍。
　　 結(jié)論：首先成功建立了吸水鏈霉菌的中長期保藏方法：采用海藻糖6％+甘油8％做冷凍保護(hù)劑，快速冷凍速率降溫進(jìn)行超低溫液氮保藏，保藏存活率達(dá)到95.6％，有效提高了菌種的保藏效果，保證了菌種選育的育種效率。選取有效的物理化學(xué)誘變刺激進(jìn)行菌種誘變，開展氨基糖苷類抗性篩選，耐自身產(chǎn)物突變株選育、耐“毒性”前體突變株選育，獲得具有不同遺傳背景的突變株。開展吸水鏈霉菌原生質(zhì)體育種的研究，進(jìn)