青霉素G高產(chǎn)菌種的誘變選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化.pdf

1、本文根據(jù)青霉素G的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機理,對青霉素G產(chǎn)生菌LN21進行誘變選育,旨在獲得適合青霉素G工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株。在原有工藝和發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上,對高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件進行優(yōu)化,尋找適合高產(chǎn)菌株的工藝條件。并對米孢子的制備工藝進行了研究。
　　 以LN21砂土管保存菌種為原始出發(fā)菌株,采用自然選育的方法,篩選出5株高產(chǎn)菌株,結(jié)果表明,菌株LN2148具有良好的遺傳穩(wěn)定性,其正常型菌落純度達到98.3％,搖瓶效價

2、達到了21000 U/mL左右。采用單因塞試驗的方法對現(xiàn)有的培養(yǎng)基進行了改進,確定了斜面、種子瓶、發(fā)酵瓶培養(yǎng)基配方。
　　 以菌種LN2148為出發(fā)菌株,經(jīng)過4次的紫外線誘變,篩選得一耐苯乙酸突變菌株LN214832,其搖瓶效價提高了19.2％,達到了24032 U/mL。以突變株LN214832作為試驗菌株,系統(tǒng)地考察了斜面周期、種子培養(yǎng)時間、前體苯乙酸加入量、硫酸鎂加量等對搖瓶效價的影響。結(jié)果表明,突變株斜面周期增加1天,其

3、搖瓶效價明顯提高；單位菌絲產(chǎn)量明顯優(yōu)于出發(fā)菌株,移種時間提前了2h；加入0.2％硫酸鎂其發(fā)酵效價明顯提高；將苯乙酸的濃度調(diào)高3％,搖瓶效價提高了9.4％。
　　 使用突變株LN214832和另一性狀完全不同的菌株LR208進行原生質(zhì)體融合,篩選了16株高于出發(fā)菌株20％的融合子。經(jīng)過復(fù)篩獲得1株突變株,其搖瓶效價比菌株LN214832提高了25％,比菌株LR208提高了28％,其搖瓶單位效價達到了31000 U/mL,將該菌株編

4、號為LN21-R-48。同時考察了酶的種類、菌絲培養(yǎng)時間、酶解溫度、酶的用量及酶消化時間對原生質(zhì)體的釋放速率的影響。結(jié)果表明,Novozyme234酶釋放速度快；菌絲培養(yǎng)48 h原生質(zhì)體釋放量最高；采用30℃酶解,原生質(zhì)體釋放量和再生頻率較高；150 mg/g濕菌絲的酶量能使菌絲徹底消化；酶解3 h效果較好。
　　 以高產(chǎn)菌株LN21-R-48為試驗菌株對菌株的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,最終確定了適合菌株LN21-R-48的培養(yǎng)條件:

5、種子培養(yǎng)基初始pH以6.0為好；種子培養(yǎng)溫度25～28℃；種齡以42～48 h為好。
　　 米孢子制備工藝從菌落形態(tài)、菌落培養(yǎng)時間和生產(chǎn)能力的關(guān)系以及分別對母米的種類、小米的調(diào)制方法等進行考察,研究不同情況下的產(chǎn)孢量和發(fā)芽率的情況。最后再改變培養(yǎng)容器的形式、裝量及水分增重等條件,研究其對產(chǎn)孢量、發(fā)芽率的影響等。菌種LN21-R-48在現(xiàn)行培養(yǎng)條件下最佳培養(yǎng)時間是9天,這時整體菌落形態(tài)較好,平均生產(chǎn)能力最高；250 mL,三角瓶裝