基于核酸穩(wěn)定熒光銅納米顆粒的生化分子檢測(cè)研究.pdf

1、近年來(lái)，熒光金屬納米簇（納米顆粒）作為一類新型的熒光納米材料，因其具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等納米材料的共有性質(zhì)，同時(shí)還展現(xiàn)出了一系列獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和優(yōu)異的生物相容性等獨(dú)特性質(zhì)而備受關(guān)注。目前，熒光金屬納米簇（納米顆粒）的合成主要通過(guò)模板介導(dǎo)法，常用的模板有:硫醇類、有機(jī)高分子聚合物、蛋白質(zhì)、核酸等。在這些模板中，核酸因其具有靈活多變、易人工合成、易功能化修飾以及生物毒性低等優(yōu)勢(shì)在生物分析傳感方面而成為研究

2、熱點(diǎn)。核酸為模板介導(dǎo)合成的熒光金屬納米簇（納米顆粒）的諸多優(yōu)勢(shì)，如易于制備、低成本、低毒性、較大的斯托克斯位移(Stokesshift)以及較高的熒光量子產(chǎn)率等，使其在生物分析檢測(cè)、生物標(biāo)記及熒光成像等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本論文選取以核酸為模板介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒作為信號(hào)單元，構(gòu)建了基于核酸為模板介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒作為探針用于雙氧水和氧化酶底物以及Dam甲基化酶檢測(cè)，具體包括以下兩個(gè)工作:
　　一、基于單鏈poly T穩(wěn)

3、定熒光銅納米顆粒的雙氧水及氧化酶底物檢測(cè)研究
　　與其他熒光金屬納米材料相比，核酸為模板介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒由于合成簡(jiǎn)便、快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)而在分析傳感領(lǐng)域得到廣泛的研究和應(yīng)用。在本工作中，我們發(fā)展了一種“綠色”納米染料，即基于單鏈poly T介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒，并將其用于雙氧水及氧化酶底物（以葡萄糖為模型分析物）檢測(cè)。當(dāng)無(wú)靶標(biāo)H2O2時(shí)，poly T能夠介導(dǎo)合成具有強(qiáng)熒光信號(hào)的銅納米顆粒;然而，當(dāng)靶標(biāo)H2O2存在時(shí)，體

4、系中微量的Fe2+將會(huì)引發(fā)芬頓反應(yīng)的發(fā)生，使得產(chǎn)生大量的強(qiáng)氧化性羥基自由基(·OH)，進(jìn)而將模板poly T切斷成很短的核苷酸鏈甚至成為單核苷酸，從而失去介導(dǎo)熒光銅納米顆粒形成的能力而無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)。根據(jù)有無(wú)靶標(biāo)時(shí)熒光信號(hào)的差異可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。通過(guò)利用H2O2作為媒介物，該策略還可以用于氧化酶底物（葡糖糖、乙酰膽堿和黃嘌呤等）的檢測(cè)研究。本文以葡萄糖作為模式分析物，其在葡萄糖氧化酶的作用下能夠產(chǎn)生H2O2，體系中微量Fe2+引發(fā)芬頓反

5、應(yīng)，進(jìn)而破壞模板poly T，失去介導(dǎo)熒光銅納米顆粒形成的能力而無(wú)法檢測(cè)到熒光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的檢測(cè)。本方法構(gòu)建的單鏈poly T介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒作為熒光指示劑不僅可以用于水溶液中雙氧水和葡萄糖的檢測(cè)，還可以用于復(fù)雜生物體系（血液）當(dāng)中葡萄糖的檢測(cè)，并具有良好的線性關(guān)系和較低的檢測(cè)限。因此，該方法將會(huì)為發(fā)展更多的簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)而有效的分析手段用于生物醫(yī)學(xué)和臨床實(shí)際應(yīng)用提供一個(gè)新的視野。
　　二、基于雙鏈poly(AT/T

6、A)穩(wěn)定熒光銅納米顆粒的Dam甲基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)研究
　　作為表觀遺傳學(xué)修飾的主要形式，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和修復(fù)、細(xì)胞分化以及胚胎發(fā)育等生物過(guò)程起著極其重要的作用。異常的DNA甲基化將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，目前已經(jīng)有大量的研究表明了基因的異常甲基化不僅與衰老有關(guān)，甚至能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，發(fā)展一類DNA甲基化酶高靈敏的檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)測(cè)DNA甲基化水平和甲基轉(zhuǎn)移酶活性都具有重要意義?；诖?，本文基于poly(AT/T

7、A)介導(dǎo)合成的熒光銅納米顆粒作為熒光探針，構(gòu)建了一種免標(biāo)記、高靈敏檢測(cè)Dam甲基酶的方法。本文以包含有Dam甲基酶的識(shí)別位點(diǎn)（5'-G-A-T-C-3'/3'-C-T-A-G-5'）的聚AT/TA雙鏈序列作為模板即poly(AT/TA)，并加入了能特異性切割甲基化(5'-G-ACH3-T-C-3'/3'C-T-ACH3-G-5')的限制性內(nèi)切酶Dpn-Ⅰ。當(dāng)無(wú)靶標(biāo)Dam甲基酶存在時(shí)，poly(AT/TA)不能發(fā)生甲基化作用，因此，對(duì)甲基

8、化敏感的限制性內(nèi)切酶DpnⅠ無(wú)法識(shí)別和切斷模板poly(AT/TA)，引入一定濃度的銅離子和抗壞血酸鈉時(shí)，銅納米顆粒將于模板poly(AT/TA)上有效合成;當(dāng)靶標(biāo)Dam甲基酶存在時(shí)，引起模板poly(AT/TA)上的位點(diǎn)（5'-G-A-T-C-3'/3'-C-T-A-G-5'）發(fā)生了甲基化，進(jìn)而可被限制性內(nèi)切酶DpnⅠ識(shí)別并切割成短鏈，導(dǎo)致熒光銅納米顆粒的合成能力減弱甚至無(wú)法合成。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Dam甲基轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)便、快速和靈敏的檢測(cè)，