近紅外核殼熒光納米顆粒的生化分析應(yīng)用及新型壓電免疫傳感器研究.pdf

1、染料摻雜熒光納米顆粒相對于量子點、熒光染料和等離子體共振顆粒而言具有諸如高量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性、親水性及易于使各種功能團在其表面修飾等顯著的優(yōu)點，所以近年來關(guān)于染料摻雜熒光納米顆粒的研究報道時有增加，也引起了眾多研究者的關(guān)注。但目前幾乎所有的研究報道都集中于那些在可見區(qū)域激發(fā)的染料的包埋，這些染料摻雜的熒光納米顆粒易于受自身熒光或細胞和體內(nèi)測量的內(nèi)濾效應(yīng)的影響，從而限制了熒光納米顆粒在生物分析、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。相對于常規(guī)熒光檢測

2、而言，在近紅外光區(qū)的熒光檢測，生物基體光吸收或熒光強度很小，且致密介質(zhì)(如組織)的光散射明顯降低，激發(fā)光的穿透性更強，因而自發(fā)熒光的背景干擾顯著降低，可以高靈敏和選擇性地檢測復(fù)雜生物分子及活細胞中的特定成分。而且，由于全血在近紅外區(qū)域具有很弱的吸收，所以有望發(fā)展一種基于近紅外熒光納米顆粒對全血樣品無需分離的直接檢測方法。本論文前半部份報告有關(guān)近紅外核殼熒光納米顆粒的生化分析應(yīng)用研究結(jié)果。針對目前熒光納米顆粒的研究現(xiàn)狀，發(fā)展了一種新型近紅

3、外核殼熒光納米顆粒，并將其進行生物標記應(yīng)用于全血樣品中腫瘤標志物、白血病細胞及單堿基突變的直接檢測。此外，利用納米金的凝集變色效應(yīng)，尚建立了一種新的等溫滾環(huán)擴增反應(yīng)的單堿基突變檢測方法。主要內(nèi)容如下： (1) 基于一種改進的合成方法制備了新型近紅外核殼熒光納米顆粒。通過引入疏水性的硅醇鹽作為納米粒子內(nèi)核，接著在油包水的微乳液中通過氨水催化正硅酸乙酯水解形成一層親水的硅外殼，合成了核殼型的亞甲基蘭摻雜熒光納米顆粒，并對納米顆粒的合

4、成條件進行了優(yōu)化。這種納米顆粒的熒光明顯強于用常規(guī)方法合成的納米顆粒，且納米顆粒的光穩(wěn)定性明顯增強，在水中幾乎沒有染料泄漏。納米顆粒呈均勻的圓球型，大小一致，直徑大約為65 nm。由于熒光分子在硅基質(zhì)中得到了很好的保護，從而可免于被環(huán)境所污染。同時，基于近紅外熒光的特性構(gòu)建了一種新型近紅外熒光納米粒子的熒光各向異性免疫凝集分析方法，用于直接檢測全血樣品中的腫瘤標記物——甲胎蛋白(AFP)，而不需經(jīng)過分離步驟。結(jié)果表明，近紅外熒光納米探針

5、在這種復(fù)雜的生物體系中不受背景的干擾，因此可以快速進行全血樣品中AFP的直接檢測。 (2)結(jié)合cell-SELEX技術(shù)篩選得到能特異性識別人急性淋巴白血病細胞的核酸適體的高特異性和核殼型近紅外熒光納米顆粒的優(yōu)點，發(fā)展了一種能快速實現(xiàn)全血樣品中腫瘤細胞的識別新技術(shù)，該方法簡便、快速、靈敏，可望用于癌癥的早期診斷、治療方案的選擇及預(yù)后的判斷。 (3) 結(jié)合運用連接酶反應(yīng)和核殼型熒光納米顆粒，提出了一種基于熒光各向異性技術(shù)與D

6、NA連接酶的高保真性的檢測方法，用予單堿基突變的直接檢測。該方法使用一個等位特異的識別探針和一個普通的探針，這兩條探針都標記在熒光納米顆粒的表面。當這兩條DNA探針與目標鏈發(fā)生雜交反應(yīng)時，就引起熒光納米顆粒的凝集，從而引起熒光探針的熒光各向異性值的增加。當識別探針3’端的堿基與目標鏈完全匹配時，DNA連接酶就會把這兩條探針之間的缺口封閉，反之，當識別探針3’端的堿基與目標鏈不匹配時，缺口就不能被封閉。對于不匹配的情況，當加熱解鏈形成的雙

7、鏈時，凝集的熒光納米顆粒就會彼此分開，溶液的熒光各向異性值將恢復(fù)到初始值；而對于完全匹配的情況，溶液的熒光各向異性值仍保持納米粒子團聚后的值。因此，通過靈敏的熒光各向異性檢測就能很好地實現(xiàn)單堿基突變的檢測。用該方法對結(jié)腸癌k-ras基因的第12位密碼子的突變情況進行了檢測，使突變型和野生型得到了很好的區(qū)分。 (4) 結(jié)合本實驗室在基因單堿基突變檢測技術(shù)方面已有的研究成果，利用核酸修飾納米金的這一凝集變色特性，提出了一種新的等溫滾

8、環(huán)擴增反應(yīng)的檢測方法，并用于人β地中海貧血基因-28位點的點突變靈敏定量檢測。該方法能夠區(qū)分突變的雜合子或純合子，為DNA目標鏈單堿基突變的臨床醫(yī)學(xué)診斷提供了一種新的途徑。 本論文的余下部分報告有關(guān)新型壓電免疫傳感器的研究成果。針對當前免疫傳感器傳感界面構(gòu)建研究中存在的問題，在實驗室原有工作的基礎(chǔ)上，以壓電石英晶體微天平為換能器，結(jié)合自組裝膜技術(shù)、納米生物修飾技術(shù)及聚電解質(zhì)吸附組裝技術(shù)，設(shè)計了一系列免疫活性材料固定化新方法，以期

9、提高壓電免疫傳感技術(shù)用于臨床實際診斷的可行性。同時，由于壓電石英晶體微天平很難實現(xiàn)對小分子物質(zhì)的直接檢測，所以利用大分子親和素與生物素之間的親和力，設(shè)計了一種石英晶體微天平實現(xiàn)對小分子生物素的檢測的方法。 (5)結(jié)合電聚合膜和納米金自組裝技術(shù)，提出了一種新的生物分子固定化方法，研制成一種檢測抗胰蛋白酶的壓電免疫傳感器。通過在石英晶振金電極表面電聚合鄰苯二胺膜，再在膜表面自組裝一層納米金粒，以靜電吸附作用固定抗體(抗原)，實現(xiàn)對相

10、應(yīng)抗原(抗體)的檢測。利用掃描電鏡技術(shù)，從形態(tài)上考察了晶振金電極上自組裝納米金后的表面形貌?？疾炝丝贵w的固定化條件，探討了傳感器的響應(yīng)與再生性能。結(jié)果表明，這種固定化方法對所固定的生物分子的生物活性影響小，傳感器的測定靈敏度高，響應(yīng)性能和再生性能較好。 (6)基于Nafion膜界面構(gòu)建了一種石英晶體微天平免疫傳感器，用于血清中補體C4的檢測。Nafion膜界面的表面形貌通過掃描電子顯微鏡進行表征?？疾炝丝贵w靜電吸附過程，抗體固定

11、的最佳條件以及免疫反應(yīng)過程，所構(gòu)建的免疫傳感器測定補體C4的線性濃度范圍為0.08-1.6μg/mL，檢測相對標準偏差低于5.3％。該傳感器制作簡便，也易于使用后再生。 (7) 通過帶相反電荷聚電解質(zhì)可交替吸附的自組裝技術(shù)，研制了一種新型的生物傳感界面。在壓電石英晶體微天平(QCM)的金電極表面，修飾巰基乙酸(MAA)自組裝單層膜(SAM)和帶相反電荷聚電解質(zhì)的多層自組裝膜。然后將具有雙面膠功能的帶正電荷的殼聚糖分子連接帶負電荷的褐藻酸

12、鈉-HSA抗體分子到負電性的MAA-SAM層。并實時考察了傳感界面的組裝過程和組裝條件，運用原子力顯微鏡(AFM)考察了每層組裝膜的表面形貌。與傳統(tǒng)的抗體直接固定方法相比，本文提出的新型免疫傳感技術(shù)能很好地保持抗體的活性，使靈敏度顯著提高，也使傳感器檢測的線性范圍明顯變寬。尤其這種傳感器具有簡便而快速的再生性能。因此這種新的生物傳感界面，在開發(fā)新的生物傳感器件上具有潛在的優(yōu)勢。 (8)結(jié)合自組裝技術(shù)和聚電解質(zhì)間的靜電吸附作用，在

13、石英晶振的金電極表面構(gòu)建了半胱胺自組裝膜和殼聚糖/褐藻酸鈉相反電荷聚電解質(zhì)的多層自組裝膜的傳感界面，研制成一種檢測人血清中B因子的壓電免疫傳感器?？疾炝藰擞浛贵w的固定化條件，探討了傳感器的響應(yīng)與再生性能。與戊二醛共價交聯(lián)固定方法相比較，這種優(yōu)化的固定化方法所獲得的傳感器響應(yīng)的頻移值大，檢測限低，檢測范圍寬，靈敏度高，傳感器能夠簡便地實現(xiàn)再生。而且這種固定化方法有利于傳感器上所固定的蛋白質(zhì)分子的生物活性的保持。特異性實驗和回收率結(jié)果表明，

14、該傳感系統(tǒng)可發(fā)展成臨床檢測B因子的一種有效工具。 (9)提出了一種新型的石英晶體微天平生物傳感器用于小分子生物素的測定，該傳感器是基于巰基化合物在金基底上穩(wěn)固的混合自組裝單層膜以及生物素和生物素類似化合物HABA與親和素之間生物親和力的不同。親和素與固定于電極表面的HABA形成一種亞穩(wěn)態(tài)分子復(fù)合物，當該傳感器接觸到包含生物素的樣品溶液時，亞穩(wěn)態(tài)分子復(fù)合物中的親和素由于與溶液中生物素形成更為穩(wěn)定的復(fù)合物而被拉離傳感器表面，從而引起