生姜蛋白酶分離純化及品種間差異性比較.pdf

1、生姜在我國栽培歷史悠久，是重要的調(diào)味品和重要的中藥。本實(shí)驗(yàn)以優(yōu)質(zhì)萊蕪大姜為原料，研究了生姜蛋白酶的提取、純化及活性檢測(cè)技術(shù)，另外，以38種生姜為原料，測(cè)定不同品種生姜的蛋白酶、姜黃素、姜辣素的含量。
　　 （1）生姜蛋白酶活性測(cè)定方法
　　 最佳酶促反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時(shí)間為5min，以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品計(jì)算酶活力值。通過比較紫外分光光度法（Abs280nm法）和Lowery法兩種酶活測(cè)定方法，證明紫外分光光度法（Ab

2、s280nm法）具有操作簡便、穩(wěn)定性高、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，以此方法測(cè)得生姜蛋白酶在最適反應(yīng)條件時(shí)的米氏常數(shù)為46.18μg/mL。
　　 （2）生姜蛋白酶提取方法
　　 通過正交試驗(yàn)及方差分析，姜汁浸提法方案為：緩沖液pH7.5、離子強(qiáng)度0.03mol/L、料液比1:2、無水乙醇用量1:2.5，按此方案進(jìn)行生姜蛋白酶的提取，得到的粗酶活力值843.7U，粗酶得率為1.40％。乙醇粉法提取生姜蛋白酶最佳提取工藝條件為：緩沖液

3、pH6.5、離子強(qiáng)度0.10mol/L、打漿用無水乙醇料液比1:3。按此方案進(jìn)行生姜蛋白酶的提取，測(cè)得酶活力值601.5U，粗酶得率為1.39％。
　　 （3）柱層析法純化生姜蛋白酶
　　 使用Sephadex G-50 Medium為填料純化生姜蛋白酶時(shí)，最佳層析柱為16×500mm，洗脫條件是：柱床體積（CBV）為100mL，洗脫速度1.5mL/min，洗脫緩沖液為磷酸緩沖液（pH7.50.03mol/L），上樣量為

4、3mL（蛋白質(zhì)含量42.7μg/mL）時(shí)。以此洗脫條件進(jìn)行尺寸排阻層析（SEC）純化，可以得到兩個(gè)明顯的洗脫峰，其中峰Ⅰ有酶活性。以姜汁酶活力為基準(zhǔn)，粗酶的比活力為其1.98倍，而經(jīng)過SEC純化后，以比活力為考察指標(biāo)純化倍數(shù)達(dá)到4.19倍，是粗酶的2.11倍。
　　 使用Cellulose DE-52（洗脫速度0.5mL/min）與Sepharose DE-52（FastFlow）（洗脫速度1.0mL/min）兩種填料進(jìn)行離子交

5、換層析（IEC）純化，采用階段洗脫法（總用量50mL，初始緩沖液與極限緩沖液變化梯度為5mL，共10個(gè)梯度）均可以得到6個(gè)較明顯的蛋白峰，其中，以CelluloseDE-52為填料時(shí)，峰Ⅲ和峰Ⅳ有酶活；而用Scpharose DE-52 Fast Flow為填料時(shí)，峰Ⅱ和峰Ⅲ有酶活。離子交換層析結(jié)果與生姜蛋白酶的等電點(diǎn)有關(guān)，即生姜蛋白粗酶經(jīng)過IEC純化后，得到了兩個(gè)等電點(diǎn)不同的組分，且都是酸性蛋白質(zhì)。
　　 （4）生姜蛋白酶活力

6、保護(hù)
　　 在緩沖液中添加半胱氨酸能有效地保護(hù)生姜蛋白酶活力，在室溫（25℃）時(shí)，以0.015mol/L的半胱氨酸保持酶活力效果最好，保存180min的酶樣品活力值為保存15min時(shí)的85％。在低溫（4℃）時(shí)，0.020mol/L的半胱氨酸酶活力保持效果最好，保存第8天時(shí)活力值為第1天時(shí)的87％。
　　 （5）38種生姜資源調(diào)查
　　 不同品種生姜的蛋白酶、姜黃素、姜辣素的含量均有較大的差異，以生姜蛋白酶比活力為