氨基糖核苷酸的酶法合成研究及其在糖綴合物制備中的應(yīng)用.pdf

1、生物體內(nèi)存在兩種重要的氨基己糖，分別是N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，在結(jié)構(gòu)和功能方面均發(fā)揮重要的作用。它們不僅是細(xì)菌細(xì)胞壁骨架和糖胺聚糖的基本組分，還存在于具有重要生物功能的糖蛋白或糖脂的糖鏈部分的核心結(jié)構(gòu)中。合成含有這兩種氨基己糖及其結(jié)構(gòu)類似物的糖綴合物，對研究它們參與介導(dǎo)的生物過程及糖類藥物開發(fā)具有重要的意義。
　　研究糖鏈的生物學(xué)功能，首先需要獲得結(jié)構(gòu)明確且均一的糖綴合物。直接從生物

2、來源分離得到的糖或糖綴合物的結(jié)構(gòu)具有微不均一性;利用有機(jī)化學(xué)法合成糖綴合物的步驟復(fù)雜，且收率較低。利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)具有高度區(qū)位特異性和立體特異性的特點(diǎn)，模擬生物體內(nèi)糖鏈的合成步驟，在體外用酶法制備結(jié)構(gòu)均一的糖鏈成為有機(jī)化學(xué)合成法的有效替代途徑。
　　但利用Leloir型糖基轉(zhuǎn)移酶在體外大量制備生物活性寡糖仍然存在兩個(gè)問題:1）用于寡糖合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的數(shù)量和種類有限;2）糖核苷酸供體底物數(shù)量有限、難以獲得且價(jià)格昂貴。這兩個(gè)

3、制約糖生物學(xué)研究發(fā)展的問題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了糖及糖綴合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。
　　糖核苷酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是核苷二磷酸或核苷一磷酸與不同單糖的異頭碳羥基連接形成的衍生物，是單糖的活化形式，能夠被糖基轉(zhuǎn)移酶識(shí)別并添加到糖鏈中。實(shí)現(xiàn)糖核苷酸衍生物的體外大量制備，為生物活性寡糖的體外制備提供原材料，對糖生物工程重要產(chǎn)品開發(fā)、糖綴合物生理生化功能研究及藥物開發(fā)具有重大意義。
　　論文的目標(biāo)之一是氨基糖核苷酸及其衍生物的酶法合成研究。主要

4、是酶法高效合成UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc結(jié)構(gòu)類似物。人源的UDP-GalNAc焦磷酸化酶(HomosapiensUDP-GalNAcpyrophosphorylase，AGX1)對GalNAc-1-P具有極高的催化活性，通過一步反應(yīng)能催化合成UDP-GalNAc。通過構(gòu)建重組載體，AGX1在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高純度的可溶性表達(dá)。論文中系統(tǒng)研究了AGX1的生物化學(xué)性質(zhì)，AGX1在含有10mMMgCl2的pH8.0100m

5、MTris-HCl緩沖液中具有最佳活性，最適反應(yīng)溫度為37℃。AGX1對不同核苷三磷酸的底物適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，該酶可以利用UTP/dUTP/dTTP作為底物，而對同樣是嘧啶類核苷酸的CTP則完全沒有催化能力。結(jié)合該酶的晶體結(jié)構(gòu)，推測核苷三磷酸底物中的堿基部分C4-位環(huán)外氧原子與AGX1的特定氨基酸位點(diǎn)之間形成氫鍵相互作用從而能夠與酶結(jié)合。CTP的C4-位上氨基的存在阻礙了氫鍵的形成，影響了底物與酶的結(jié)合。AGX1對不同糖-1-磷酸的底物適

6、應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，C2-乙酰氨基在酶與底物識(shí)別結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用。不含N-乙酰氨基的Glc-1-P不能被AGX1利用。酶動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以UTP/dUTP/dTTP為NTP供體時(shí)，AGX1利用GalNAc-1-P的能力略高于GlcNAc-1-P。對核苷三磷酸的喜好順序?yàn)?UTP＞dUTP＞dTTP。通常情況下，真核來源的焦磷酸化酶的底物適應(yīng)性都比較有限，而AGX1卻具有較為廣泛的底物適應(yīng)性，這是一個(gè)非常重要的發(fā)現(xiàn)，其意義在于可以利用該

7、酶廣泛的底物適應(yīng)性在體外合成多種稀有核苷酸，對于糖基轉(zhuǎn)移酶的生化性質(zhì)研究和糖核苷酸物質(zhì)庫的豐富具有重要意義?；贏GX1的底物利用廣泛性特點(diǎn)，我們研究了利用AGX1體外合成稀有糖核苷酸的技術(shù)路線，制備了2種稀有糖核苷酸，dUDP-GalNAc和dTDP-GalNAc，這些產(chǎn)物可以用于相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)研究。
　　空腸彎曲菌（Campylobacterjejuni）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)含有蛋白N-糖基化過程的原核生物。論文第三章通過對空

8、腸彎曲菌糖基化途徑的分析，找到一種新型的UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(CampylobacterjejuniUDP-GlcNAcpyrophosphorylase，CjGImU)。CjGlmU在原核表達(dá)系統(tǒng)中得到了高純度的可溶性表達(dá)。CjGlmU對不同糖-1-P底物適應(yīng)性的研究發(fā)現(xiàn)，CjGlmU對Glc-1-P同樣具有較高的反應(yīng)產(chǎn)率，這表明C2-位N-乙酰基不是酶對底物識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)。但隨著N-乙酰基上修飾基團(tuán)空間位阻的變大，CjGl

9、mU的催化能力也隨之減弱，分析可能是較大的空間位阻影響了酶與底物的相互結(jié)合。C4-位羥基的構(gòu)型是影響酶與底物識(shí)別及催化能力的關(guān)鍵因素，同樣是以UTP作為供體底物，CjGlmU對GalNAc-1-P的催化效率僅為GlcNAc-1-P的12％左右。CjGImU對不同核苷三磷酸底物的適應(yīng)性的研究表明，CjGlmU對嘧啶類核苷酸底物的利用率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于嘌呤類核苷酸底物。與EcGlmU（EscherichiacoliK12來源的UDP-GlcNAc

10、焦磷酸化酶）相比，CjGlmU具有更廣泛的核苷三磷酸底物適應(yīng)性。CTP能夠很好地被CjGlmU利用，合成CDP-GlcNAc的效率在60％以上。CjGlmU可以催化合成16種稀有糖核苷酸，其中對7種稀有糖核苷酸的產(chǎn)率能夠達(dá)到60％以上，其他的9種也均在20％左右?；谠撁笍V泛的底物適應(yīng)性，我們在體外成功地制備了3種UDP-GlcNAc的衍生物，分別是CDP-GlcNAc，UDP-GlcNBu和UDP-GlcNPr。CjGlmU的研究工作

11、為體外大量制備非天然糖核苷酸奠定了基礎(chǔ)，利用該酶的催化反應(yīng)，能夠合成數(shù)十種稀有糖核苷酸。通過對產(chǎn)物的分離純化，極大豐富了糖核苷酸化合物庫，為糖基轉(zhuǎn)移酶的活性研究和含非天然糖殘基的糖綴合物的合成研究提供了豐富的供體底物。
　　氨基糖核苷酸作為Leloir型糖基轉(zhuǎn)移酶的糖供體，參與了生物體內(nèi)重要糖綴合物的合成過程。論文的另一部分工作重點(diǎn)就是將合成制備的氨基糖核苷酸及其衍生物用于糖基轉(zhuǎn)移酶合成復(fù)雜糖綴合物的研究中。糖基轉(zhuǎn)移酶是體外制備生

12、物活性寡糖的一類重要的工具酶，探索不同種來源的糖基轉(zhuǎn)移酶并研究其生物化學(xué)性質(zhì)，能夠極大地促進(jìn)糖生物學(xué)的研究和糖類藥物的開發(fā)。論文第四章，我們克隆了一種來源于幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)的β1，3-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（β1，3-N-acetylglucosaminyltransferase，HpLgtA），該酶以UDP-GlcNAc為糖供體，催化將GlcNAc以β1，3鍵連接到半乳糖殘基上。該酶也是poly-La

13、cNAc合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，該酶被過量表達(dá)為帶有N-端MBP標(biāo)簽和C-端His6標(biāo)簽的可溶性蛋白。實(shí)驗(yàn)中使用了34種糖核苷酸研究HpLgtA的底物適應(yīng)性，并對比了已知活性的來源于腦膜炎奈瑟氏球菌（Neisseriameningitidis）的同功能的糖基轉(zhuǎn)移酶（NmLgtA）。HpLgtA與NmLgtA都可以利用其中的8種糖核苷酸作為底物，但利用特異性上存在差異。二者均對N-?；鶐в行揎椈鶊F(tuán)的UDP-GlcNAc結(jié)

14、構(gòu)類似物具有催化活性;N-?；先〈鶊F(tuán)空間位阻的不斷增大使酶的催化活性逐漸降低。除此之外，HpLgtA還可以利用C6-位帶有修飾基團(tuán)的結(jié)構(gòu)類似物。UDP-Glc和UDP-GalNAc均不是這兩種糖基轉(zhuǎn)移酶的合適底物。由此推測，N-?；拇嬖诩癈4-羥基的構(gòu)型是影響酶與底物相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。二者氨基酸序列上38％的相似性也可以揭示這一發(fā)現(xiàn)。對其中3種底物的酶動(dòng)力學(xué)研究表明，HpLgtA比NmLgtA具有稍高的催化效率，UDP-GlcN

15、Ac是二者的最適底物。隨著N-?；闲揎椈鶊F(tuán)的空間位阻逐漸變大，二者的催化效率也逐漸降低。利用該酶較廣泛的底物適應(yīng)性，可以在體外制備含有GlcNAc結(jié)構(gòu)類似物的糖鏈(poly-LacNAc)，并對糖鏈功能的改變做進(jìn)一步的研究。
　　透明質(zhì)酸(Hyaluronan，HA)是最簡單的一種糖胺聚糖，以游離形式（不與蛋白共價(jià)結(jié)合）存在于生物體內(nèi)。具有良好的水溶性與粘彈性，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥，美容等領(lǐng)域。透明質(zhì)酸糖鏈的長度的和不同的化學(xué)修飾

16、都能影響其生物學(xué)功能。論文第五章，利用來源于A型巴斯德氏菌（Pasteurellamultocida）的透明質(zhì)酸合酶(hyaluronansynthase，PmHAS)作為工具，以生物素標(biāo)記的葡萄糖醛酸(GlcA-Biotin)作為受體底物，采用逐步合成的方法在體外制備了生物素標(biāo)記的透明質(zhì)酸二糖，三糖。并進(jìn)一步選用單糖，二糖和三糖作為前體對PmHAS的聚合能力進(jìn)行了研究。研究工作發(fā)現(xiàn)，PmHAS對單糖（GlcA或GlcNAc）不具有聚合

17、能力。但能以生物素標(biāo)記的單糖、二糖及三糖作為前體物質(zhì)，利用UDP-GlcA和UDP-GlcNAc作為糖基供體，通過聚合反應(yīng)，最終生成HA糖鏈。而且以三糖為前體時(shí)的聚合速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二糖和單糖，前體的糖鏈長度越大，越有利于PmHAS催化的聚合反應(yīng)的進(jìn)行。
　　綜上所述，本論文建立了一套高效的酶法合成制備UDP-GlcNAc/GalNAc結(jié)構(gòu)類似物的體系。利用真核來源的AGX1和原核來源的CjGlmU分別合成了6種和16種UDP-Gl