蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過(guò)程中集聚體和中間態(tài)的研究.pdf

1、本文以溶菌酶為模型蛋白研究了蛋白質(zhì)的復(fù)性機(jī)理。用熒光相圖法研究了蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過(guò)程的中間態(tài)，用陰極聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和高效凝膠排阻層析法(SEC)研究了蛋清溶菌酶稀釋復(fù)性過(guò)程形成的集聚體。本研究結(jié)果為探索蛋白質(zhì)折疊機(jī)理提供了有益的幫助。 在用熒光相圖法研究脲和鹽酸胍誘導(dǎo)去折疊蛋清溶菌酶的折疊過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：當(dāng)去折疊體系中有還原劑β-巰基乙醇時(shí)，還原變性溶菌酶的稀

2、釋復(fù)性過(guò)程中都沒(méi)有中間態(tài)產(chǎn)生，符合典型的“二態(tài)模型”；當(dāng)去折疊體系中沒(méi)有還原劑存在時(shí)，變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)中間態(tài)，符合“四態(tài)模型”。 當(dāng)用復(fù)性緩沖液稀釋還原脲變性溶菌酶時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生可觀量的沉淀。上清液和沉淀的非還原SDS-PAGE結(jié)果表明還原脲變性溶菌酶除了能直接復(fù)性成天然態(tài)溶菌酶分子外，還能在上清液中形成溶菌酶分子三聚體，同時(shí)在沉淀中形成溶菌酶分子二聚體。上清液的SEC分析結(jié)果也驗(yàn)證了上清液中含有溶菌酶分子

3、三聚體。上清液和沉淀的還原SDS-PAGE結(jié)果表明，二聚體和三聚體主要是還原脲變性溶菌酶分子通過(guò)分子間二硫鍵錯(cuò)配形成的。同時(shí)沉淀的陰極PAGE電泳和在復(fù)性過(guò)程中加入SDS的復(fù)性結(jié)果表明復(fù)性過(guò)程中形成的二聚體是可溶的，可溶的溶菌酶分子二聚體之間通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用形成了溶菌酶分子四聚體沉淀。 非還原脲變性溶菌酶稀釋復(fù)性液的非還原SDS-PAGE結(jié)果表明當(dāng)溶菌酶濃度小于7.0mg/mL時(shí)，復(fù)性過(guò)程中不會(huì)形成集聚體；而當(dāng)溶菌酶濃度大于

4、7.0mg/mL時(shí)，復(fù)性過(guò)程中會(huì)形成溶菌酶分子二聚體和三聚體。復(fù)性液的陰極PAGE表明，當(dāng)溶菌酶濃度小于4.0mg/mL時(shí)，復(fù)性過(guò)程中不會(huì)形成集聚體；而當(dāng)溶菌酶濃度大于4.0mg/mL時(shí)，復(fù)性過(guò)程中會(huì)形成溶菌酶分子二聚體和三聚體。同時(shí)，復(fù)性液的SEC結(jié)果也證實(shí)了非還原脲變性蛋清溶菌酶在復(fù)性過(guò)程中產(chǎn)生了溶菌酶分子二聚體和三聚體。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論：(Ⅰ)還原脲和鹽酸胍變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程中沒(méi)有中間態(tài)產(chǎn)生，它們的

5、復(fù)性過(guò)程均為“二態(tài)過(guò)程”。還原脲變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程為：還原脲變性溶菌酶分子通過(guò)分子間二硫鍵錯(cuò)配形成可溶的溶菌酶分子二聚體和三聚體，然后可溶的二聚體之間以非共價(jià)鍵相互作用形成四聚體沉淀。(Ⅱ)非還原脲和鹽酸胍變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程中都產(chǎn)生兩個(gè)中間態(tài)，它們的復(fù)性過(guò)程均為“四態(tài)過(guò)程”。非還原脲變性溶菌酶的稀釋復(fù)性過(guò)程為：當(dāng)溶菌酶濃度小于4.0mg/mL時(shí)，復(fù)性過(guò)程中不形成集聚體；當(dāng)溶菌酶濃度為4.0～7.0mg/mL時(shí)，中間態(tài)會(huì)由于分