哈氏噬纖維菌β-葡萄糖苷酶CHU-2273的性質(zhì)研究.pdf

1、在當(dāng)今世界資源逐步枯竭及能源短缺的情況下，各國(guó)都致力于開發(fā)生物質(zhì)能源，其中木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用越來越受到人們的重視。但是，纖維素自身結(jié)構(gòu)致密，并存在結(jié)晶區(qū)，不容易被酶解，這就為纖維素的高效性生物降解研究帶來了很大難題。因此，研究高效降解纖維素的微生物菌株具有重要的意義。哈氏噬纖維菌Cytophagahutchinsonii是一種自然界中廣泛分布的纖維素降解細(xì)菌，能快速、徹底地降解結(jié)晶纖維素，但其既不分泌游離的纖維素酶，也不存在纖維小體結(jié)

2、構(gòu)，據(jù)此推測(cè)，哈氏噬纖維菌具有不同于其他纖維素降解菌的獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制。
　　β-葡萄糖苷酶，水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，在纖維素的降解速率中起到關(guān)鍵性調(diào)控作用，可有效解除纖維二糖積累對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性的抑制作用，是纖維素徹底降解中的必需酶。深入研究β-葡萄糖苷酶，提高纖維素酶的降解效率，對(duì)于纖維素的降解利用及闡述哈氏噬纖維菌獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制都具有重要意義。
　　本文以研究哈氏噬纖維菌的β

3、-葡萄糖苷酶基因?yàn)槟繕?biāo)，通過復(fù)性電泳發(fā)現(xiàn)了哈氏菌外膜上的β-葡萄糖苷酶，隨后圍繞β-葡萄糖苷酶基因的鑒定、克隆、異源表達(dá)、分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)等方面進(jìn)行了一系列的探討研究。主要包括以下內(nèi)容:
　　1、實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)哈氏噬纖維菌的β-葡萄糖苷酶酶活絕大部分都存在于細(xì)胞表面，本文提取哈氏菌膜蛋白，對(duì)其進(jìn)行NativePAGE，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的活性顯色只有一條帶，質(zhì)譜鑒定該酶為CHU_2273，對(duì)其進(jìn)行分析，該基因長(zhǎng)度為2463

4、bp，編碼820個(gè)氨基酸，分子量為89613，是屬于糖苷水解酶第三家族的β-葡萄糖苷酶，序列分析預(yù)測(cè)含有3個(gè)二硫鍵，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，且在氨基酸序列上具有嗜冷酶的特點(diǎn)。
　　2、將NativePAGE鑒定出的β-葡萄糖苷酶基因CHU_2273構(gòu)建到原核表達(dá)載體pMALC2X中，并將其導(dǎo)入在大腸桿菌JM109中，誘導(dǎo)后成功獲得了高效表達(dá)的重組β-葡萄糖苷酶，進(jìn)行親和純化后得到了電泳純的CHU_2273酶。
　　3、對(duì)純化后的重

5、組蛋白CHU_2273進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)溫度為20℃，最適pH為6.8，熱穩(wěn)定性較差，是在中溫菌種發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)嗜冷性β-葡萄糖苷酶。論文進(jìn)一步研究了各種金屬離子和化合物對(duì)CHU_2273酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)Ni+、Co2+、Cu2+、K+和Mg2+對(duì)酶活有不同程度的抑制作用;Ca2+對(duì)酶活有促進(jìn)作用;化合物中δ-葡萄糖酸內(nèi)酯、SDS對(duì)CHU_2273具有強(qiáng)烈的抑制作用，甲醇、乙醇也有較強(qiáng)的抑制作用，巰基乙醇對(duì)酶活的影響不