哈氏噬纖維菌β-葡萄糖苷酶CHU-2273的性質(zhì)研究.pdf

1、在當(dāng)今世界資源逐步枯竭及能源短缺的情況下，各國都致力于開發(fā)生物質(zhì)能源，其中木質(zhì)纖維素的開發(fā)利用越來越受到人們的重視。但是，纖維素自身結(jié)構(gòu)致密，并存在結(jié)晶區(qū)，不容易被酶解，這就為纖維素的高效性生物降解研究帶來了很大難題。因此，研究高效降解纖維素的微生物菌株具有重要的意義。哈氏噬纖維菌Cytophagahutchinsonii是一種自然界中廣泛分布的纖維素降解細(xì)菌，能快速、徹底地降解結(jié)晶纖維素，但其既不分泌游離的纖維素酶，也不存在纖維小體結(jié)

2、構(gòu)，據(jù)此推測，哈氏噬纖維菌具有不同于其他纖維素降解菌的獨特的纖維素降解機制。
　　β-葡萄糖苷酶，水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，在纖維素的降解速率中起到關(guān)鍵性調(diào)控作用，可有效解除纖維二糖積累對內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶的活性的抑制作用，是纖維素徹底降解中的必需酶。深入研究β-葡萄糖苷酶，提高纖維素酶的降解效率，對于纖維素的降解利用及闡述哈氏噬纖維菌獨特的纖維素降解機制都具有重要意義。
　　本文以研究哈氏噬纖維菌的β

3、-葡萄糖苷酶基因為目標(biāo)，通過復(fù)性電泳發(fā)現(xiàn)了哈氏菌外膜上的β-葡萄糖苷酶，隨后圍繞β-葡萄糖苷酶基因的鑒定、克隆、異源表達、分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)等方面進行了一系列的探討研究。主要包括以下內(nèi)容:
　　1、實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)哈氏噬纖維菌的β-葡萄糖苷酶酶活絕大部分都存在于細(xì)胞表面，本文提取哈氏菌膜蛋白，對其進行NativePAGE，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的活性顯色只有一條帶，質(zhì)譜鑒定該酶為CHU_2273，對其進行分析，該基因長度為2463

4、bp，編碼820個氨基酸，分子量為89613，是屬于糖苷水解酶第三家族的β-葡萄糖苷酶，序列分析預(yù)測含有3個二硫鍵，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，且在氨基酸序列上具有嗜冷酶的特點。
　　2、將NativePAGE鑒定出的β-葡萄糖苷酶基因CHU_2273構(gòu)建到原核表達載體pMALC2X中，并將其導(dǎo)入在大腸桿菌JM109中，誘導(dǎo)后成功獲得了高效表達的重組β-葡萄糖苷酶，進行親和純化后得到了電泳純的CHU_2273酶。
　　3、對純化后的重

5、組蛋白CHU_2273進行酶學(xué)性質(zhì)研究。發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)溫度為20℃，最適pH為6.8，熱穩(wěn)定性較差，是在中溫菌種發(fā)現(xiàn)的第一個嗜冷性β-葡萄糖苷酶。論文進一步研究了各種金屬離子和化合物對CHU_2273酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)Ni+、Co2+、Cu2+、K+和Mg2+對酶活有不同程度的抑制作用;Ca2+對酶活有促進作用;化合物中δ-葡萄糖酸內(nèi)酯、SDS對CHU_2273具有強烈的抑制作用，甲醇、乙醇也有較強的抑制作用，巰基乙醇對酶活的影響不