顯微MR成像技術在腫瘤實驗研究中的應用.pdf

1、基因治療和生物治療的興起決定了開展小動物成像的必要性,傳統(tǒng)的研究方法大部分局限于實驗室內,常采用分子生物學技術驗證預期結果.但是活體內復雜的內環(huán)境和多種影響因素決定了將實驗室中得到的研究結果應用于臨床尚存在極大的差距,我們需要一種介于實驗室研究和臨床應用之間的中間環(huán)節(jié),最近在表現(xiàn)型成像方面引起了注意. 分子基因學家想方設法以動物模擬人類疾病,醫(yī)藥公司為了研制新的藥物和劑型,因此需要大量的轉基因或基因缺失的小鼠,特別是開發(fā)新型抗腫

2、瘤藥物和探索新的抗腫瘤途徑,更加需要可靠的活體內監(jiān)測方法.小鼠費用的增加和某些轉基因鼠的相對缺乏促使研究者考慮以活體的小鼠成像來代替宰殺后行組織學檢查的方法,為了促進人類疾病動物模型研究中高分辨率成像技術的發(fā)展,美國癌癥研究所資助了數(shù)個小型動物成像資源項目. 小動物的成像對于儀器有特殊的要求, 20g的小鼠和70Kg的人類有明顯的不同.最近幾年,小動物專用的成像系統(tǒng)的研究興趣增加,目前國外廣泛使用的動物磁共振成像系統(tǒng)(Magnet

3、ic resonance imaging,MR imaging)是采用動物專用MR系統(tǒng)和線圈,但是費用昂貴,每臺需要100萬美元以上,甚至國外的研究機構難以購置大型的顯微MR成像系統(tǒng),根據(jù)我國目前的經(jīng)濟發(fā)展水平,大部分研究單位更加難以購置如此昂貴的研究儀器.本研究擬基于廣泛應用的臨床型MR系統(tǒng)結合小動物線圈分別行幼年大鼠MRS成像、小鼠種植性腫瘤的成像,以代替目前昂貴的小動物專用MR成像系統(tǒng). 活體內追蹤和監(jiān)視納米顆粒的活性以及

4、了解納米級顆粒載體粘附和藥物釋放規(guī)律對于抗腫瘤藥物納米化載體研制和改進以及未來的臨床應用有重要價值.作為藥物和生物活性物質的載體,藥物學家和臨床醫(yī)師必須在早期就明確納米顆粒載體是否吸附固定于靶器官或組織、目的物質是否釋放出來并與靶組織發(fā)生相互作用以及能夠持續(xù)多長時間發(fā)揮其生物學作用,首先,顯示納米顆粒是否吸附到位顯然是優(yōu)先需要解決的問題.由于MR成像無創(chuàng)傷性,具有極高的軟組織分辨率,因此成為較理想的研究手段.本課題將合成可以MR體內示蹤

5、的納米載體,活體內顯示該載體在小鼠結腸壁的粘附和吸收現(xiàn)象,為以后的靶向抗腫瘤藥物納米載體研究提供可靠的活體內觀察手段. 研究目的: 1.探索利用臨床型MR系統(tǒng)進行小動物<'1>HMRS分析的掃描技術和應用可行性; 2.探索臨床型MR成像系統(tǒng)和小動物線圈行小鼠腫瘤模型成像的可行性,為小鼠腫瘤模型的研究和新型治療措施提供活體內觀察手段; 3.合成包裹MR對比劑Gd-DTPA的多糖類殼聚糖納米載體顆粒,并以MR

6、成像方法在體顯示殼聚糖納米載體腸壁粘附和吸收現(xiàn)象,實現(xiàn)納米載體的MR分子成像; 4.以MR常用對比劑Gd-DTPA標記合成含熒光素FITC(Fluorescein isothiocyaJlate)的Gd-ODA-FITC(Gadolenium-otcadecylamine-fluorescein isothiocyanate)載藥固體脂質納米粒(Solid liposome nanoparticles,SLN)藥物載體,并探索以

7、MR成像監(jiān)測含Gd-ODA-FITC的納米載體在結腸壁的吸附現(xiàn)象,實現(xiàn)靶向固態(tài)脂質體納米顆粒載體的MR分子成像. 5.擴展臨床型MR成像系統(tǒng)的應用范圍,代替昂貴的動物專用磁共振成像系統(tǒng)開展小動物腫瘤模型顯微成像和分子影像學研究.通過納米顆粒載體的MR成像,為以后經(jīng)結腸粘膜途徑的結腸腫瘤的靶向診斷和治療提供可靠的影像學依據(jù),為新型靶向載體和藥物的開發(fā)提供理論依據(jù). 材料和方法: 1.所有實驗均采用臨床型1.5T的

8、MR掃描儀和小動物線圈進行成像.以高熱浴水法制作10只雄性幼年SD大鼠抽搐動物模型(大鼠體重25g),以PRESS(point resolved spectroscopy)法行高熱抽搐處理組多體素腦部<'1>H質子MR波譜成像和常規(guī)T2WI掃描成像,對照組選擇10只正常幼年SD大鼠,同樣方法行<'1>HMRs成像.根據(jù)MRs結果判斷有無乳酸波峰,分別測量Cho/NAA、Cr/NAA、Cho/Cr和Lac/Cr比值,比較正常組和處理組各波

9、峰高度比值差異并行統(tǒng)計學處理,結果與常規(guī)T<,2>WI圖像對照后者有無腦組織信號異常; 2.建立20只小鼠皮下種植性S-180腫瘤模型,7天后以1.5T臨床型MR成像系統(tǒng)和小動物線圈行MR成像,MR成像序列為化學位移脂肪抑制FLAIR-T<,1>WI和T<,2>WI掃描序列,采用橫斷位掃描,測量橫斷位腫瘤最大徑,根據(jù)MR圖像判斷腫瘤內有無出血壞死、腹壁肌肉侵犯等.小鼠處死后解剖腫瘤,以對應MR圖像測量腫瘤橫徑,觀察有無與腹壁肌肉

10、和皮膚粘連,切開腫塊后判斷有無瘤內出血壞死; 3.以乳滴聚結法合成包裹MR對比劑Gd-DTPA的殼聚糖納米顆粒載體Gd-nanoCPS(Gadolinium-chitosan nanoparticles),對照組顆粒內無Gd-DTPA的Nano-CPS顆粒.測定顆粒形態(tài)、大小和對比劑的包埋率.體外試驗分別以T<,1>WI、T<,2>WI、GRE-T<,2><'*>WI和FLAIR-TlWI序列掃描含有Gd-nanoCPS顆粒、

11、Nano-CPS顆?；鞈乙骸?.1mg﹪NNNGd-DTPA溶液和普通水,測定各種液體信號.體內試驗標記組和對照組分別為8只成年雄性昆明小鼠.將Gd-nanoCPS混懸液逆行灌注已經(jīng)清潔灌腸后的小鼠直腸內,保留灌腸40分鐘后充分清潔結腸.分別于灌注前、保留灌注中和清潔結腸后以脂肪抑制FLAIR-T<,1>WI和T<,2>WI序列橫斷掃描直腸或結腸;對照組以同樣方法選取同樣濃度的Nano-CPS混懸液灌腸,掃描后取組織送電鏡觀察.在FLA

12、IR-T<,1>WI序列圖像測量灌注前后結/直腸壁、肌肉和圖像背景磁共振信號強度(SIr<,pre>,SIm<,pre>和SIn<,pre>)(SIr<,post>,SIm<,post>和SIn<,post>),計算SIr<,pre>/SIm<,pre>SIn<,pre>/SIm<,pre>和SIr<,post>/SIm<,post>,SIn<,post>/SIm<,post>比值.比較灌注前后結/直腸壁信號變化,統(tǒng)計學采用t檢驗;

13、 4.以溶劑擴散法(Solvent diffusion method)合成包裹等量Gd-DTPA和FITC-ODA的Gd-ODA-FITC和無Gd-D17PA的對照組單純ODA-FITC固態(tài)脂質體納米顆粒載體,測定納米顆粒大小和包裹效率.體外試驗分別以PDWI、T<,2>WI、T<,2><'*>GRE和FLAIR-T<,1>WI序列掃描含有兩種顆?；鞈乙汉推胀ㄋ?測定各液體信號.體內試驗標記組和對照組分別為7只和5只成年雄性昆明小鼠

14、.將含Gd-ODA-FITC的顆?；鞈乙耗嫘泄嘧⒁呀?jīng)清潔灌腸后的小鼠直腸內,保留灌腸40分鐘后充分清潔結腸.分別于灌注前、保留灌注中和清潔結腸后以脂肪抑制FLAIR-T<,1>WI和T<,2>WI序列橫斷位掃描直腸及結腸;對照組以同樣方法選取同樣濃度的含ODA-FITC顆?；鞈乙罕Ａ艄嗄c,掃描后取直腸冰凍切片后以熒光顯微鏡觀察FITC熒光強度和腸壁分布,HE染色對照熒光物質相對應組織學解剖位置.在FLAIR-T<,1>WI序列圖像測量灌

15、注前后腸壁、肌肉和圖像背景磁共振信號強度(SIr<,pre>,SIm<,pre>和SIn<,pre>)(SIr<,post>,SIm<,post和Sin<,post>),計算SIr<,pre>/SIm<,pre>,Sln<,pre>/SIm<,pre>和SIr<,post>/SIm<,post>,SIn<,post>/SIm<,post>比值.比較灌注前后腸壁信號變化,統(tǒng)計學采用t檢驗. 結論: 1.臨床型MR結合小動

16、物線圈可以成功進行幼年大鼠的<'1>HMRs成像,反映正常腦組織和動物模型腦代謝物的變化,是活體內研究大鼠級腦腫瘤等疾病模型代謝變化的可靠方法. 2.臨床型MR成像系統(tǒng)結合小動物線圈可以清晰顯示皮下種植腫瘤特性以及周圍侵犯情況,是活體內研究小鼠皮下種植性腫瘤生長和療效觀察的的可靠手段. 3.MR對比劑Gd-DTPA可以成功標記殼聚糖納米顆粒載體并以MR成像顯示載體直腸壁粘附和吸收現(xiàn)象,MR成像是活體內監(jiān)測靶向納米載體的有

17、效技術. 4.Gd<'2+>標記的Gd-ODA-FITC納米顆粒是一種非常有前途的可以熒光觀察對照的靶向脂質體對比劑,MR成像技術可以活體內顯示Gd<'2+>標記的固態(tài)脂質體顆粒載體結腸壁粘附和吸收現(xiàn)象,MR成像是活體內監(jiān)測靶向載藥固態(tài)脂質體納米粒載體的有效技術. 5.采用價格相對便宜的小動物線圈,可以將臨床型的MR成像系統(tǒng)應用到小動物腫瘤模型研究和分子影像學研究中,部分代替小動物專用MR成像系統(tǒng).以MR對比劑標記的靶向