鳙魚中多聚磷酸鹽水解機理及無磷保水劑的研究.pdf

1、本文針對多聚磷酸鹽在水產(chǎn)品中檢測及水解等問題進行了研究，以鳙魚為對象，建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的測定方法，分離純化了焦磷酸鹽水解酶和三聚磷酸鹽水解酶，闡明了多聚磷酸鹽水解機理和保水機理，并開發(fā)了安全高效的磷酸鹽替代品。結(jié)論分述如下： 1。建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽測定的離子色譜法。利用Dionex ICS 2000型離子色譜，Asll.Hc型陰離子分離柱，以氫氧化鉀為淋洗液，采取程序梯度洗脫可以對單磷酸鹽(Pi)、焦磷酸鹽(PP)

2、、三聚磷酸鹽(TPP)、六偏磷酸鹽(HMP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷三磷酸(ATP)進行定性定量分析。Pi、PP、TPP在0.005-0.5mmol/L的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r<'2>＞0.999，HMP相關(guān)系數(shù)r<'2>＞0.99。采用三氯乙酸超聲波萃取，在鳙魚肉中的回收率為99-111％，能夠用以測定鳙魚和其它水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽。 2.對不同水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的水解規(guī)律進行了研究。使用本文建立的離子色譜

3、法可以準確地測定TSPP和STPP在不同水產(chǎn)中的水解。STPP水解分為兩步，首先被水解成PP和Pi，其次生成的PP被進一步水解成Pi。而添加的TSPP直接被水解成單磷酸鹽。TSPP和STPP中間水解產(chǎn)物PP的水解消弱了其提高肌肉保水性的功能特性。 3.本方法利用Dionex ICS 2000型離子色譜，ASll-HC型陰離子分離柱，以氫氧化鉀為淋洗液，采取程序梯度洗脫可以非常準確地測定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和

4、Pi。ATP、ADP和Pi在0.01-0.1mmol/L測量濃度范圍內(nèi)與電導值具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。在此基礎(chǔ)上建立了魚肉Ca-ATPase活性的離子色譜測定法，為ATPase的研究提供了新的方法。 4.對鳙魚焦磷酸鹽水解酶(PPase)進行了分離純化和生化特性的研究。肌肉通過0.05 mol/L KCl-20 mmol/L tris-HCl(pH7.0)緩沖液漂洗得到的粗酶液，經(jīng)過50％～80％(NH<,

5、4>)<,2>SO<,4>飽和度分段鹽析，50℃加熱處理，經(jīng)DE52陰離子交換線性洗脫層析，再經(jīng)Sephacryl S-300凝膠層析可以得到在native PAGE和SDS-PAGE圖譜上呈現(xiàn)單一蛋白條帶的純化酶。純化倍數(shù)為114.5倍，酶活回收率為4.5％。鳙魚中的PPase的相對分子量為50kDa，是有兩個相同的分子量為25kDa的亞基構(gòu)成，最適溫度和pH分別為50℃和8.0，該酶的熱穩(wěn)定性不強，在pH5.0-10.的范圍內(nèi)有著很

6、好的穩(wěn)定性。Mg<'2+>是該酶的必需離子，當Mg<'2+>濃度與底物濃度比值≥1時，酶活性較高且保持穩(wěn)定。但當?shù)孜餄舛雀哂贛g<'2+>濃度時，底物對酶活性有一定的抑制作用。Co<'2+>和Mn<'2+>對。PPase也有一定的激活作用。低濃度的EDTA可以激活酶，而高濃度的EDTA卻能強烈抑制酶活。PPase酶可能為金屬蛋白酶。DTT可以增強酶活性。而檸檬酸鈉和亞硫酸氫鈉可以強烈抑制酶活。絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑PMSF可以完全抑

7、制酶活性，該酶可能為絲氨酸蛋白酶。在5mmol/L Mg<'2+>濃度下，PPase水解焦磷酸四鈉的Km為1.98mmol/L。 5.通過逐層剖析法證明了肌球蛋白頭部S-1具有TPPase活性，并闡明了鳙魚肌球蛋白頭部S-1 TPPase的生化特性。 純化的鳙魚TPPase水解Tpp的最適溫度為30℃。TPPase在30℃下比較穩(wěn)定，在保溫60min后仍具有較高的活性，但隨溫度升高穩(wěn)定性下降，在70℃下迅速失活。TPPa

8、se最適pH值為5.0和8.0，在中性偏酸的環(huán)境中較穩(wěn)定。TPPase活性受到Mg<'2+>的影響，在低于17mmol/L濃度下，TPPase活性隨Mg<'2+>濃度升高而升高，但高濃度的Mg<'2+>對TPPase卻起到了抑制作用。KCl對TPPase活性有一定的影響，當濃度由0.1 mol/L提高到0.3mol/L 時TPPase活性迅速升高，但是當KCI濃度進一步升高時，酶活性趨于穩(wěn)定不再發(fā)生變化。EDTA-Na<,2>能顯著抑制

9、TPPase活力，而：Mg<'2+>可以緩解這種抑制作用。TPPase對于氧化劑和還原劑都比較穩(wěn)定。在0.3 mol/L KCl、5mmol/L Mg<'2+>和pH 8.0反應體系條件下測定鳙魚TPPase的米氏常數(shù)為3.2mmol/L。 6.研究了三種多聚磷酸鹽對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響，探討了提高保水性的機理。氯化鈉在高離子強度下能夠破壞鳙魚肌原纖維結(jié)構(gòu)，使肌原纖維小片化并溶解。提出了焦磷酸鹽提高保水性的機理為：一，通過提高

10、蛋白靜電斥力，使肌原纖維橫向膨脹，增加肌原纖維內(nèi)部的空間；二，從A帶兩端提取蛋白，破壞肌動蛋白和Z盤的連接，增加I帶空間；三，從H帶提取蛋白，破壞肌球蛋白桿部連接，增加A帶內(nèi)部空間；四，高濃度下能從整個A帶中提取蛋白，破壞肌球蛋白和肌動蛋白的連接，粗絲和細絲分離，肌原纖維小片化，促進肌原纖維蛋白的溶解，提高可溶性蛋白含量。三聚磷酸鹽作用途徑與焦磷酸鹽類似，一方面通過靜電斥力使肌原纖維橫向膨脹；另一方面提高離子強度增加蛋白質(zhì)的溶解；第三方

11、面是通過三聚磷酸鹽水解酶水解成焦磷酸鹽，然后以焦磷酸鹽形式發(fā)揮作用。焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽高能化學鍵的水解會釋放能量可能會解離肌動球蛋白，影響肌原纖維結(jié)構(gòu)。六偏磷酸鹽對肌原纖維結(jié)構(gòu)不具備強烈的融脹破壞作用，而是使肌原纖維收縮變細，內(nèi)部空間大大減少，造成水分大量流失。在生產(chǎn)中使用的復合磷酸鹽常含有六偏磷酸鹽，其主要作用可能是螯合金屬離子，影響三聚磷酸鹽水解酶和焦磷酸鹽水解酶活性，進而影響三聚磷酸鹽和焦磷酸鹽的作用。 7．對磷酸鹽替代

12、物進行了研究。利用化學法獲得的分子量大于6kDa的褐藻酸鈉裂解物HDX-A可以有效的增加南美白對蝦蝦仁的浸泡增重效果。在1％的浸泡液中處理1h，增重率可達到13％左右；HDX-A可以顯著保持冷凍蝦仁浸泡增重效果，防止了解凍損失，降低了蒸煮損失，保持了蝦仁的鮮嫩。在南美白對蝦冷凍蝦仁應用效果優(yōu)于B542復合磷酸鹽。提出HDX-A提高冷凍蝦仁的保水性的可能機理為： 一，通過滲透作用進入到蝦仁內(nèi)部，利用自身膨脹增加了肌束之間和肌原纖維