HBsAg在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景:
　　原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率具有逐漸上升趨勢(shì),乙型肝炎是導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的最重要原因。
　　HBsAg在肝癌中的表達(dá)情況一直有學(xué)者在研究。通過對(duì)原發(fā)性肝癌組織、癌旁組織研究,結(jié)果一般都認(rèn)為肝癌組織中HBsAg陽(yáng)性率相對(duì)癌旁組織要明顯降低。我們推測(cè)原因,除了在基因和轉(zhuǎn)錄水平控制HBsAg的表達(dá),肝癌細(xì)胞還可能在翻譯后加工水平調(diào)

2、節(jié)HBsAg的結(jié)構(gòu)和抗原特性。換言之,肝癌細(xì)胞分泌的HBsAg的翻譯后修飾或空間構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致免疫原性改變,腫瘤從而逃逸宿主的免疫反應(yīng)。如果有一種特異性抗體只結(jié)合肝癌細(xì)胞分泌的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的HBsAg,特別是在肝癌細(xì)胞膜上表達(dá)的HBsAg,那么針對(duì)HBsAg的乙肝相關(guān)性肝癌免疫治療就會(huì)取得突破性進(jìn)展。目前還有研究報(bào)道HBsAg在癌旁組織中的表達(dá)特征可能會(huì)和肝癌診斷和預(yù)后相關(guān)。
　　研究目的:
　　為了驗(yàn)證以上推測(cè),我們計(jì)

3、劃制備HBsAg單克隆抗體,利用流式細(xì)胞技術(shù)、ELISA方法和免疫組化方法來(lái)檢測(cè)這些抗體的結(jié)合能力和結(jié)合特點(diǎn),以期能發(fā)現(xiàn)特異性識(shí)別肝癌細(xì)胞膜上的HBsAg的抗體。同時(shí)我們還可以利用制備的抗體來(lái)分析肝癌組織和癌旁組織HBsAg不同表達(dá)特點(diǎn),結(jié)合臨床資料,尋找HBsAg表達(dá)特點(diǎn)與肝癌預(yù)后之間的相關(guān)性,為臨床預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)提供新的標(biāo)志物。
　　材料和方法:
　　1.單克隆抗體的制備和檢測(cè),利用已有的HBsAg免疫Balb/c小鼠

4、,應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備單HBsAg單克隆抗體。應(yīng)用ELISA,流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)所獲抗體。
　　2.篩查抗體在肝癌標(biāo)本中的表達(dá)特性:選取手術(shù)切除的肝癌組織標(biāo)本,用14種雜交瘤上清分別與之進(jìn)行免疫組化和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè),初步分析每個(gè)抗體在人肝癌手術(shù)標(biāo)本中的表達(dá)特征。
　　3.分析肝癌的臨床病理預(yù)后。實(shí)驗(yàn)收集2007年1月-2009年6月解放軍總醫(yī)院乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者手術(shù)切除蠟塊標(biāo)本,共42例。每個(gè)標(biāo)本均包括癌組織及癌旁組織

5、且臨床資料完整。選取經(jīng)過腹水純化后的抗體,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)不同抗體HBsAg的檢出率是否有差別;將患者按照腫瘤大小、AFP高低、有無(wú)門靜脈癌栓、分化程度、HBV-DNA水平、單多發(fā)癌灶、癌旁組織GGHⅠ表達(dá)水平、癌旁組織GGHⅡ表達(dá)水平進(jìn)行分組進(jìn)行生存分析,比較組別之間復(fù)發(fā)時(shí)間和生存時(shí)間有無(wú)差別;利用COX模型找出與肝癌復(fù)發(fā)和生存相關(guān)的危險(xiǎn)因素。
　　結(jié)果:
　　1.單克隆抗體制備:應(yīng)用雜交瘤技術(shù),我們獲得了14

6、個(gè)單克隆雜交瘤細(xì)胞,對(duì)雜交瘤上清進(jìn)行ELISA和流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)后,選取12種雜交瘤分別注射小鼠腹腔獲得腹水,經(jīng)過純化后,我們獲得了5種高濃度腹水抗體。
　　2.篩查抗體的特性:根據(jù)免疫組化結(jié)果,我們將抗體分為4種類型:1、癌旁組織著色強(qiáng)于癌組織;2、癌組織表達(dá)與癌旁組織著色均比較顯著;3、癌旁肝細(xì)胞和癌細(xì)胞核著色;4、肝癌細(xì)胞膜著色。針對(duì)HepG2.215細(xì)胞流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示有3種抗體表達(dá)為陽(yáng)性結(jié)果。挑選出具有代表性的第一類

7、4號(hào)和第二類2號(hào)純化腹水進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　3.2種抗體的檢出率:2號(hào)、4號(hào)抗體在癌組織中HBsAg檢出率分別為19.04％和16.66%,在癌旁組織中檢出率分別為73.81%和71.42%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),2種抗體在癌旁組織和肝癌組織中HBsAg檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.生存分析:腫瘤大小組之間、AFP高低組之間、有無(wú)癌栓組之間、2AbGGHⅡ高低組之間、4AbGGHⅡ高低組之間復(fù)發(fā)時(shí)間和生存時(shí)間均有顯著差異。(P<0