生長轉(zhuǎn)化因子-15(GDF-15)調(diào)節(jié)大鼠小腦顆粒神經(jīng)元膜離子通道表達(dá)的機制研究.pdf

1、生長分化因子15（growth differentiation factor，GDF-15），是TGF-β超家族的成員之一，在上個世紀(jì)90年代末由至少7個不同的實驗室單獨發(fā)現(xiàn)并克隆出來。被命名為巨噬細(xì)胞抑制性細(xì)胞因子（macrophage inhibitory cytokine，MIC-1），胎盤轉(zhuǎn)化生長因子（placental transformation growth factor，PTGF）-β、前列腺衍生因子(prostate

2、derived factor，PDF)，胎盤骨形態(tài)發(fā)生蛋白(placental bonemorphogenetic protein，PLAB)和非類固醇抗炎藥物激活基因(non-steroidal anti-in-flammatory drug-activated gene，NAG-1)。到目前為止，關(guān)于GDF-15的研究主要集中在其抗炎，抗細(xì)胞增殖以及抑制腫瘤生長的能力。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，研究者發(fā)現(xiàn)GDF-15是中腦多巴

3、胺能神經(jīng)元的保護因子，外周運動和感覺神經(jīng)元的新的營養(yǎng)因子、腦血管疾病及腦損傷的預(yù)測因子。但是GDF-15對神經(jīng)元膜離子通道的調(diào)控的報道卻鮮有涉及。在本人的研究中首先發(fā)現(xiàn)GDF-15能夠增加體外培養(yǎng)5天的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元上的延遲整流型K+離子電流（IK）幅度，并增加細(xì)胞中介導(dǎo)IK電流的主要通道蛋白Kv2.1的表達(dá)。此外，通過生物素標(biāo)記膜蛋白的方法檢測到膜上Kv2.1蛋白的增加。利用western blotting和定量PCR的方法我們檢

4、測到雖然Kv2.1蛋白表達(dá)增加，但其mRNA水平?jīng)]有變化，使用放線菌素阻斷蛋白轉(zhuǎn)錄并不能抑制Kv2.1的蛋白增加，而使用cycloheximide阻斷蛋白翻譯后發(fā)現(xiàn)GDF-15的作用被抑制，所以我們初步確定GDF-15影響了Kv2.1蛋白的翻譯，但不影響轉(zhuǎn)錄。除了翻譯和轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控之外，細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量還受蛋白降解過程的影響。利用cycloheximide chase發(fā)現(xiàn)GDF-15處理的細(xì)胞中Kv2.1降解的速度明顯低于contro

5、l組。已知溶酶體和蛋白酶體介導(dǎo)胞內(nèi)兩種主要蛋白質(zhì)降解途徑。接下來使用MG132和leupeptin分別阻斷蛋白酶體降解途徑和溶酶體降解途徑，發(fā)現(xiàn)GDF-15還能通過溶酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑影響Kv2.1的胞內(nèi)含量。GDF-15之前被發(fā)現(xiàn)在低鉀無血清條件下，能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β和MAPK/ERK信號通路抑制培養(yǎng)的顆粒神經(jīng)元凋亡。我們發(fā)現(xiàn)GDF-15在短時間內(nèi)大幅增加Akt，ERK1/2，mTOR的磷酸化水平。有趣的是，利

6、用U0126阻斷MEK/ERK信號通路，我們發(fā)現(xiàn)GDF-15的作用不能被阻斷且GDF-15提高ERK1/2磷酸化水平的現(xiàn)象也不能被U0126阻斷。利用LY294002和rapamycin阻斷Akt/mTOR信號途徑，發(fā)現(xiàn)抑制GDF-15的作用被有效抑制，且驗證mTOR信號在Akt信號下游。通過半定量PCR我們發(fā)現(xiàn)TGF-β受體二型（TβRⅡ）的mRNA水平隨細(xì)胞發(fā)育天數(shù)變化而改變，而TGF-β受體一型(TβRⅠ)的mRNA水平則相對穩(wěn)定

7、。單獨使用TβRⅠ的阻斷劑(LY364947，SB431542，和PP1)并不能抑制GDF-15的作用，而使用TβRⅠ和TβRⅡ的阻斷劑(PP2 and LY2109761)能顯著抑制GDF-15引起的對Kv2.1，Akt/mTOR信號通路以及MAPK/ERK信號通路的作用。IP實驗揭示GDF-15能增加TβRⅡ在Tyr位點上的磷酸化，而LY2109761能阻斷GDF-15對受體磷酸化的作用。
　　同時我們也發(fā)現(xiàn)GDF-15增加顆

8、粒神經(jīng)元GABAAα6蛋白的表達(dá)以及pCREB的磷酸化程度。這兩個指標(biāo)提示GDF-15可能還與細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)。通過鈣成像實驗測定顆粒神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度動態(tài)變化后，我們發(fā)現(xiàn)GDF-15增加顆粒神經(jīng)元高鉀刺激下胞內(nèi)鈣提升的程度。運用膜片鉗記錄，我們發(fā)現(xiàn)，顆粒神經(jīng)元中去極化激發(fā)的鈣通道電流隨著體外培養(yǎng)天數(shù)的增加而增大;而在體外培養(yǎng)5天的神經(jīng)元上發(fā)現(xiàn)，GDF-15的孵育會使L-型鈣通道介導(dǎo)的鈣電流顯著增大，并且這個效應(yīng)至少部分是通過上調(diào)C