大鼠退變椎間盤中環(huán)氧化酶-2、缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系.pdf

1、隨著我國的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人民生活水平逐漸提高，國民的平均壽命也較過去明顯延長。但是人口老齡化帶來的一系列問題又反過來妨礙人民生活質(zhì)量的改善，因此，這是一個充滿矛盾而又急需解決的問題。人口老齡化帶來的問題，主要體現(xiàn)在老年性疾病的患病率增加，而脊柱退變性疾病則是其中一組患病率極高，又嚴(yán)重影響人們生活的疾病。脊柱退行性改變引起的局部病理解剖學(xué)、病理生理學(xué)的變化，這些變化的結(jié)果不僅可以導(dǎo)致椎間盤功能異常、椎管狹窄，同時還可能影響運(yùn)動節(jié)段

2、的穩(wěn)定性，出現(xiàn)異?；顒樱@種異?；顒佑挚梢赃M(jìn)一步破壞椎間盤的結(jié)構(gòu)與功能，從而加劇椎間盤退變與破壞。椎間盤在脊柱退變過程中最早發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)，而椎間盤退變是出現(xiàn)各種脊柱退變性疾病如:椎間盤突出癥、腰椎退變性滑脫、椎管狹窄癥、椎間盤源性疼痛等疾病的病理基礎(chǔ)。當(dāng)脊柱出現(xiàn)以上病變時，脊髓、神經(jīng)根及馬尾神經(jīng)將受到突出的椎間盤組織、狹窄的椎管擠壓，導(dǎo)致出現(xiàn)四肢感覺異常、行走不穩(wěn)、肌力減弱、大小便障礙等，如受壓的神經(jīng)根發(fā)生炎癥，或纖維環(huán)外層的竇椎神經(jīng)

3、末梢受炎癥刺激，還可出現(xiàn)頸腰痛及肢體放射痛。雖然目前認(rèn)為椎間盤的退變過程是從人體發(fā)育完全后開始的，主要表現(xiàn)為髓核內(nèi)的水分以及蛋白多糖隨著年齡增加而逐漸減少，Ⅰ型膠原蛋白的逐漸增加，致使椎間盤載荷能力隨之減低，但是關(guān)于椎間盤退變的確切機(jī)制目前仍未完全明了，除了知道其跟普遍認(rèn)同的力學(xué)因素、生化因素以及神經(jīng)生理因素相關(guān)之外，還跟免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。如細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡、椎間盤內(nèi)的蛋白多糖含量減少、新生血管的形成等都被普遍地認(rèn)

4、為在椎間盤退變的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。新生血管形成在椎間盤退變過程中的作用，目前仍無定論，國內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為，椎間盤中新生血管的形成是椎間盤的一種保護(hù)機(jī)制，因椎間盤內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)主要來自上下終板及纖維環(huán)的被動擴(kuò)散，而椎間盤退變開始后，營養(yǎng)物質(zhì)的被動擴(kuò)散減弱，機(jī)體為了保證椎間盤內(nèi)的營養(yǎng)供應(yīng)及修復(fù)退變的椎間盤，椎間盤內(nèi)代償性生成血管。但是，持反對觀點(diǎn)的學(xué)者們認(rèn)為，本無血管的椎間盤內(nèi)出現(xiàn)血管，使得椎間盤內(nèi)本來無活性的基質(zhì)降解酶原從血液中獲得

5、激活的因子，從而使椎間盤的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解，最終導(dǎo)致椎間盤發(fā)生退變。
　　 環(huán)氧化酶(COX)又稱前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，是一種雙功能酶，目前發(fā)現(xiàn)其有兩種同工酶:COX-1和COX-2。其中COX-2是誘導(dǎo)型蛋白，目前已證實其在多種惡性腫瘤內(nèi)血管形成過程中起上調(diào)作用。此外，COX-2還是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類物質(zhì)的限速酶。COX-2可通過多條途徑促進(jìn)血管生成，如:上調(diào)VEGF、bel-2表

6、達(dá);血栓素A2、PGE2等這些由花生四稀酸代謝代謝而來的產(chǎn)物，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、遷移，誘導(dǎo)血管生成;此外，COX-2還可以抑制血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。應(yīng)用選擇性的COX-2抑制劑可顯著地抑制腫瘤內(nèi)的血管生成。正常的椎間盤內(nèi)無血管生成，而退變的椎間盤新生血管則較常見。同時，許多研究證實COX-2因子在退變的椎間盤內(nèi)表達(dá)較正常椎間盤內(nèi)表達(dá)明顯增高。那么COX-2因子在椎間盤新生血管形成的過程中是否也有上調(diào)作用昵？
　　 缺氧誘

7、導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，通過與低氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，引發(fā)下游基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)哺乳動物的細(xì)胞中出現(xiàn)缺氧時，其可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子。椎間盤發(fā)生退變時，營養(yǎng)物質(zhì)通過終板與纖維環(huán)的能力就顯著降低，造成椎間盤內(nèi)部相對缺氧環(huán)境，近年來研究表明退變的椎間盤內(nèi)HIF-1α表達(dá)較正常椎間盤內(nèi)明顯增高，并且不同的缺氧程度，表達(dá)情況不同。由于腫瘤組織生長十分迅速，其生長速度超過血管生成速

8、度，使其形成局部缺氧環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)。研究已經(jīng)證實，在腫瘤內(nèi)HIF-1α參與血管形成的全過程:(1)啟動階段，其能通過合成一氧化氮使血管舒張，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子及其配體的表達(dá)，使血管的通透性增加;(2)進(jìn)展階段，其能增加金屬蛋白水解酶的表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)降解、使血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)血管的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增生與遷徙，在血管生成素-2的作用下，形成結(jié)節(jié)狀的或者錐體狀的血管芽;(3)在形成階段，其在血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1等的

9、作用下，血管芽逐漸生長變形并形成血管腔，在和鄰近血管芽吻合成血管網(wǎng);(4)塑形與改造階段，其也能在血管生成素-1等的作用下，使血管壁的平滑肌和其他細(xì)胞發(fā)生遷移，包繞新生成的血管，從而形成完整壁結(jié)構(gòu)。那么在退變的椎間盤內(nèi)HIF-1α是否也通過相似的途徑促進(jìn)新生血管的形成呢？
　　 研究目的：
　　 COX-2及HIF-1α在腫瘤內(nèi)表達(dá)明顯增加，并且腫瘤內(nèi)血管形成密切相關(guān)。在動物退交的椎間盤中有血管形成，而且許多學(xué)者認(rèn)為，椎

10、間盤內(nèi)血管形成是椎間盤退變的重要因素。同時先前研究也發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤內(nèi)COX-2和HIF-1α這兩種因子的表達(dá)較正常椎間盤明顯增高，但是先前研究并沒有聯(lián)合兩種因子做檢測及研究其相關(guān)關(guān)系。所以聯(lián)合檢測并探討這兩種因子在椎間盤內(nèi)與新生血管形成的關(guān)系及這兩種因子之間的相關(guān)關(guān)系，都是本研究的的目的。
　　 研究方法：
　　 選取個3月齡的大白鼠20只（雌雄不限，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），運(yùn)用配對比較法隨機(jī)分成實驗組與對照

11、組（在分配動物前，先將大鼠按不同的月齡、性別、胎別和體重等因素配對，以各種因素基本相同的兩只動物配為一對，配成10對，每對兩只大鼠分別編號為1、2，從隨機(jī)數(shù)字表連續(xù)抄錄十個數(shù)字，從第一個數(shù)開始，如為奇數(shù)則將第一對動物的1號大鼠編入實驗組，2號大鼠入對照組;如為偶數(shù)，則將該對動物2號大鼠入實驗組，1號大鼠入對照組。如此，將20只大鼠隨機(jī)分為實驗組和對照組各10只）。將實驗組10只大鼠手術(shù)切除腰1-骶1棘突、關(guān)節(jié)突，棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)

12、豎棘肌，然后縫合切口，單獨(dú)飼養(yǎng)。對照組不行手術(shù)，與實驗組同等條件飼養(yǎng)。12周后，處死所有大鼠，取腰4/5椎間盤，制成4um厚的病理切片。每個配對中，對照組大鼠的切片通過H-E染色用于跟實驗組比較，以反映實驗組大鼠椎間盤的退變情況，對照組切片亦行免疫組化染色，但不記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，僅作陰性對照。通過免疫組化方法檢測兩組實驗動物椎間盤中COX-2、HIF-1α表達(dá)情況及CD34標(biāo)記的新生血管在退變椎間盤及正常椎間盤中表達(dá)狀況，并計數(shù)椎間盤中微血

13、管的密度(MVD)，記錄實驗組相關(guān)數(shù)據(jù)。并通過統(tǒng)計分析描述退變椎間盤中COX-2與HIF-1α之間的關(guān)系及它們分別與椎間盤微血管密度(MVD)之間的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.所有大鼠試驗期間全部存活:
　　 2.光鏡檢測結(jié)果:
　　 對照組大鼠椎間盤組織切片經(jīng)HE染色后，光鏡下可見髓核組織中膠原纖維相互平行排列，纖維粗細(xì)較均勻，未見裂隙和囊泡狀空腔;而而實驗組的椎間盤髓核組織中纖維細(xì)胞增生明顯，

14、膠原纖維排列紊亂、粗細(xì)不均，甚至發(fā)生斷裂，并可見大量纖維軟骨樣組織，髓核基質(zhì)發(fā)生玻璃樣變性。HE染色片表現(xiàn)為淡紅色的細(xì)胞團(tuán)，可見散在的或呈灶狀的壞死區(qū)，部分壞死物已經(jīng)發(fā)生液化、吸收，殘留下大小不一、長短不等的囊泡狀、蜂窩狀的裂隙和空腔;
　　 3.免疫組化染色結(jié)果:
　　 經(jīng)免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)HIF-1α和COX-2在正常的椎間盤髓核中僅有微弱表達(dá)，但在退變的髓核內(nèi)其表達(dá)明顯增加，COX-2在切片上的染色陽性部位大部分為

15、椎間盤髓核細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜，鏡下表現(xiàn)為髓核細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜上出現(xiàn)棕黃色的染色顆粒，并且附近大多有新生血管生成。而HIF-1α因子在切片上的染色陽性部位大部分為椎間盤髓核細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核，鏡下表現(xiàn)為髓核細(xì)胞胞質(zhì)或胞核上出現(xiàn)棕黃色染色顆粒，并且出現(xiàn)染色陽性細(xì)胞的部位與表達(dá)COX-2的陽性細(xì)胞的位置存在明顯重疊。用CD34標(biāo)記的微血管經(jīng)免疫組化染色后，鏡下表現(xiàn)為棕色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇。在正常的髓核組織中未出現(xiàn)或僅少量出現(xiàn)陽性結(jié)果，但是在

16、退變的髓核中其陽性結(jié)果明顯增多。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果:
　　 將本實驗所獲數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0，經(jīng)直線相關(guān)分析，退變椎間盤髓核組織內(nèi)COX-2、HIF-1α之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.705,P=0.023）;用多元線性回歸分析COX-2及HIF-1α的表達(dá)與MVD呈正相關(guān)關(guān)系;決定系數(shù)R2=0.875，COX-2的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為0.496，HIF-1α的標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)為0.517。
　　 結(jié)論：<

17、br>　　 本實驗利用制作動物模型及免疫組化染色方法，檢測大鼠退變腰椎間盤中COX-2、HIF-1α的表達(dá)及新生血管密度(MVD)得出以下結(jié)論:
　　 1.HIF-1α、COX-2在大鼠退變的髓核組織內(nèi)其表達(dá)明顯增加;
　　 2.大鼠退變椎間盤髓核組織內(nèi)COX-2、HIF-1α因子的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系;
　　 3.大鼠退變椎間盤髓核組織中MVD值與COX-2因子表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系;
　　 4.大鼠退變椎間盤