小鼠脊髓損傷后microRNA-152對神經(jīng)元突起再生作用和機制的研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)在全球的年發(fā)病率約為每百萬人口11-60例,由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)自我修復(fù)能力有限,而脊髓組織與機體感覺和運動功能密切相關(guān),SCI會使患者感覺缺失和運動功能障礙,對患者及家庭造成了巨大的痛苦和負擔。SCI在損傷后數(shù)分鐘至數(shù)年內(nèi)產(chǎn)生了一系列的病理生理變化,多種因素聯(lián)合作用導(dǎo)致機體的運動和感覺功能障礙,由于其病理過程和損傷后局部環(huán)境的復(fù)雜性,目前仍沒有滿意的治療方法,因此 SCI的研究及救治

2、是基礎(chǔ)和臨床醫(yī)務(wù)工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類約為22個核苷酸的非編碼RNA,主要通過與靶基因3'非翻譯區(qū)(3' untranslational region,3'UTR)相互結(jié)合,促使靶mRNA降解或抑制翻譯過程,但其mRNA不發(fā)生降解。miRNA的主要功能是進行基因表達轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)控機制,參與到多種生理和病理過程中,并發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。miRNA廣泛存在于各個系統(tǒng)中,其中包括中樞神經(jīng)系

3、統(tǒng),miRNA幾乎參與調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的每一個過程,包括神經(jīng)模式?jīng)Q定、神經(jīng)干細胞的命運決定、神經(jīng)細胞特性的維持和建立、軸突引導(dǎo)、突觸可塑性和長期記憶等方面。我們前期實驗發(fā)現(xiàn):對正常和SCI小鼠不同時間點進行miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn),microRNA-152(miR-152)在SCI后表達水平升高,通過原位雜交提示我們:升高的miR-152主要分布于損傷區(qū)周圍的神經(jīng)元中。miR-152同miR-148a和miR-148b均屬于miR-1

4、48/152家族,對于該家族的研究報道多數(shù)關(guān)注在免疫系統(tǒng)和癌癥方面的功能。有研究顯示 miR-152在大鼠脊髓損傷后表達升高,但其在脊髓組織中的分布及相應(yīng)的調(diào)控機制沒有闡明。通過比較成熟神經(jīng)元、神經(jīng)母細胞瘤和神經(jīng)前體細胞miRNA表達譜發(fā)現(xiàn)miR-152在成熟神經(jīng)元中低表達,推測其可能通過調(diào)控Nrp1和Robo1表達,影響軸突生長,但確切機制仍然不清。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn):miR-152在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達且自胚胎早期至出生后表達

5、水平基本呈上升趨勢;利用 qPCR證實 miR-152在小鼠脊髓損傷后表達水平升高。脊髓損傷后神經(jīng)元處于復(fù)雜的環(huán)境之中,在體外建立H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元劃傷兩種損傷模型,觀察其對神經(jīng)元中 miR-152表達的影響,發(fā)現(xiàn)兩種損傷模型均導(dǎo)致miR-152表達水平升高,并有時間依賴性。為確定miR-152對神經(jīng)元的作用,我們培養(yǎng)類神經(jīng)元細胞系PC12細胞及SH-SY5Y細胞,并分離B6小鼠皮層神經(jīng)元,體外培養(yǎng)1天后,分別給予miR-1

6、52類似物和抑制物,觀測發(fā)現(xiàn)過表達miR-152后,三種細胞突起均較對照組要短;抑制 miR-152的表達,細胞突起較對照組沒有明顯差異。利用TargetScan、PicTar等軟件和數(shù)據(jù)庫,綜合過表達miR-152后細胞突起較對照組要短的現(xiàn)象,以及前期實驗發(fā)現(xiàn),在過表達 miR-152的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中,MAP2、Tau蛋白及GAP-43的表達水平下調(diào)的結(jié)果,預(yù)測HuD(Hu antigen D,HuD)可能是miR-152的靶基

7、因;并通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)及Western-bolt技術(shù)證實HuD是miR-152的靶基因。HuD在脊髓損傷后表達水平下降,且與miR-152表達水平基本呈相反趨勢,近一步證實HuD是miR-152的靶基因。過表達miR-152后可以顯著促進 PC12細胞的增殖,并成 miR-152濃度依賴性且其作用具有細胞類型選擇性,這種現(xiàn)象可能是通過miR-152抑制CDK19表達所導(dǎo)致的。
　　小鼠脊髓損傷后 miR-152對神經(jīng)元突起再