HIF-1a調(diào)控VEGF對離體原代培養(yǎng)的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、背景:氧感受器:據(jù)知低氧誘導因子1(HIF-1)是細胞適應低氧的關鍵轉錄因子,在低氧性肺動脈高壓(HPH)也起十分重要的作用,它由氧敏感的α亞基(HIF-1α)和在核內(nèi)穩(wěn)定表達的β亞基(HIF-1β)組成的異二聚體轉錄因子。HIF-1α作為是功能性亞基,可以調(diào)控100多種涉及低氧應激下細胞適應與存活的靶基因的表達,從而在低氧應答反應中起核心作用,因而也稱為是最新一種的氧感受器。是低氧性肺血管重塑(HPSR)形成中調(diào)控目標基因表達的“分子

2、開關”。低氧誘導因子脯氨酰羥化酶(PHD1)是一種可以使HIF-1α脯氨酸殘基羥基化并調(diào)節(jié)其對氧穩(wěn)定性的重要的關鍵性酶;低氧誘導因子抑制因子(FIH)是調(diào)節(jié)HIF-1α轉錄激活活性的另外一種關鍵酶。它們通過氧敏感的方式調(diào)節(jié)低氧誘導因子活性及其表達。
　　目的:體外原代培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs),研究低氧下對大鼠PASMCs增殖的影響以及HIF-1α、PHD1、FIH、及HIF-1α靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在

3、肺動脈平滑肌細胞中的表達變化的規(guī)律及相互關系;觀察HIF-1a基因過表達和沉默對PASMC中VEGF的表達的影響,為HPH發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。
　　方法:實驗共分兩部分。第一部分,將SD大鼠消毒后剖開胸腹腔,無菌下取出心肺組織,然后分離出肺動脈段,分離大鼠肺動脈中膜層,用組織塊貼壁法培養(yǎng),倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、普通免疫組織化學法(SP法)和免疫熒光法進行細胞鑒定。然后將體外培養(yǎng)的大鼠 PASMCs,設計常氧組、低氧組

4、H2,H6,H12,H24。用四唑鹽(MTT)比色法測各組PASMCs增殖。用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測各組細胞HIF-1α、PHD1、FIH、VEGFmRNA表達水平,Western blotting法檢測HIF-1α、PHD1、FIH、VEGF的蛋白表達水平。第二部分,將HIF-1a基因轉染在大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)中,將細胞

5、分為過表達 HIF-1α組、對照組(未轉染組)和沉默 HIF-1α組。經(jīng)常氧和低氧處理后分別用Western blotting法檢測HIF-1α和VEGF的蛋白表達水平。
　　結果:(1)在不使用顯微技術情況下,用組織貼塊法成功培養(yǎng)大鼠PASMCs,得到穩(wěn)定生長、純度高的PASMCs,且培養(yǎng)與純化可以同時進行,可獲得穩(wěn)定傳代的細胞。
　　(2)采用MTT法發(fā)現(xiàn),低氧2小時后肺動脈平滑肌細胞明顯增殖,低氧24小時后細胞增殖達高

6、峰,此后增殖稍下降。HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白在常氧組表達陽性,低氧2小時后表達明顯增高,低氧6小時后達高峰,此后表達稍下降。PHD1 mRNA和蛋白在常氧組均呈陽性表達,在低氧后表達下降。FIH mRNA和蛋白在常氧組均呈陽性表達,在低氧后表達下降。VEGF mRNA和蛋白在對照組表達少量,低氧2小時后表達升高,低氧12小時后達高峰。
　　(3)在常氧下siRNA成功沉默HIF-1a基因后(siRNA-HIF-1a組

7、),PASMCs中HIF-1a和VEGF蛋白表達明顯減少,對照組(未轉染組)表達較siRNA-HIF-1a組增多,過表達HIF-1a組HIF-1a蛋白表達明顯增加;在低氧下,siRNA-HIF-1a組HIF-1A和VEGF蛋白僅少量表達,對照組開始增加,過表達組明顯增加,且低氧下各組HIF-1a和VEGF蛋白表達較常氧下各組均高。
　　(4)直線相關分析結果表明:在低氧大鼠肺肺動脈平滑肌細胞HIF-1αmRNA及蛋白與VEGF m

8、RNA、VEGF蛋白均呈正相關。HIF-1α、VEGF蛋白與平滑肌細胞增殖正相關。FIH、PHD1mRNA及蛋白與VEGF mRNA、VEGF蛋白均呈負相關。FIH、PHD1蛋白及mRNA與HIF-1a mRNA、HIF-1a蛋白均呈負相關。
　　結論:(1)低氧能促進肺動脈平滑肌細胞的低氧性增殖。(2)低氧可誘導肺動脈平滑肌細胞HIF-1a的表達。(3)HIF-1α、VEGF均參與肺動脈平滑肌細胞的增殖過程,HIF-1α可能以轉