SLE患者中幾種新型自身抗體的檢測及其臨床診斷價(jià)值的探討.pdf

1、研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種臨床表現(xiàn)多樣，可累及多個(gè)系統(tǒng)、多個(gè)臟器的自身免疫性疾病。本病好發(fā)于青年女性，發(fā)病高峰為15～40歲，男女發(fā)病比例為1∶9左右。全球的患病率約為30～50/10萬人，據(jù)我國流行病學(xué)的初步統(tǒng)計(jì)，我國的患病率約為70/10萬人-100/10萬人，且有逐年增多的趨勢。SLE發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與遺傳、環(huán)境、性激素等因素有關(guān)，但B細(xì)胞過度活化和自身抗體的產(chǎn)生在SLE發(fā)病中起了重要作用，機(jī)體產(chǎn)生的這

2、些自身抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合物沉積于皮膚、血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等處，進(jìn)而引起多組織及多器官的損害。SLE的臨床表現(xiàn)多種多樣:表現(xiàn)有反復(fù)高熱或長期低熱，脫發(fā)，關(guān)節(jié)腫脹疼痛，皮膚可出現(xiàn)面頰部蝴蝶形紅斑或盤狀紅斑，累及口腔粘膜時(shí)出現(xiàn)點(diǎn)狀出血、糜爛或潰瘍等，并且還可侵犯胸膜、心臟、腎臟，對神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均可造成損害。當(dāng)累及神經(jīng)精神系統(tǒng)稱之為神經(jīng)精神狼瘡(NPSLE)，是SLE病情嚴(yán)重的一種表現(xiàn)，且病死率高。N

3、PSLE臨床表現(xiàn)多樣，可發(fā)生在SLE任何時(shí)期，且其發(fā)病機(jī)制不清楚，但近年來大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)自身抗體可能與NPSLE發(fā)病機(jī)制相關(guān)。但目前國內(nèi)外對NPSLE診斷標(biāo)準(zhǔn)仍不完善，且缺乏早期預(yù)測和診斷NPSLE實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
　　 自身抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測已成為SLE診斷的重要依據(jù)之一，抗Sm抗體、抗磷脂抗體、抗核抗體、抗DNA抗體已被納入1997年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ARA）修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)中。但SLE是一種多種自身抗體參與的免疫性疾病，許多

4、新的可能參與SLE甚至NPSLE發(fā)病的自身抗體被越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)。
　　 抗Sm抗體是1966年Tan從名為Smith的患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種SLE標(biāo)志性抗體，是SLE患者的血清特異性標(biāo)志，在SLE患者血清中陽性率為21％-30％，其對SLE診斷特異性很高，但敏感性較低。已證實(shí)抗Sm抗體的水平與SLE疾病活動程度及臨床表現(xiàn)沒有相關(guān)性，但是，抗Sm抗體的檢測對早期、不典型的SLE或治療后的回顧性診斷具有很大幫助。目前對抗Sm抗體

5、的檢測常用的有免疫擴(kuò)散法(ID)、免疫印跡法(IBT)及免疫電泳法(CIE)三種方法，目前醫(yī)院多以IBT作為抗Sm抗體的主要檢測方法。但I(xiàn)BT法對于抗Sm抗體的檢測敏感性較高而特異性較低，主要原因在其結(jié)果判定時(shí)準(zhǔn)確性不夠，目前多數(shù)IBT法以出現(xiàn)28KD、29KD、13.5KD條帶作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，但Sm抗原具有多種異構(gòu)體成分多肽，抗Sm抗體的不同一性，與不同的Sm抗原決定簇或成分多肽親和力不同，以不同條帶作為抗Sm抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)將影響

6、IBT法對抗Sm抗體檢測的陽性率。
　　 抗心磷脂抗體(ACA)是抗磷脂抗體中的一種，可結(jié)合于紅細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂，造成紅細(xì)胞、血小板和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞受損，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成、血小板減少等損害，大量研究證實(shí)ACA在動靜脈血栓、血小板減少、自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。ACA可見于SLE或其他結(jié)締組織病，但以SLE患者中陽性率最高，可達(dá)30％-40％，研究發(fā)現(xiàn)ACA陽性與SLE患者血小板減少、血栓形成

7、、血管炎以及神經(jīng)系統(tǒng)病變有關(guān)。
　　 抗核糖體P蛋白抗體（ARPA）為針對核糖體P蛋白c末端區(qū)的抗體，主要針對60 s核糖體亞單位磷酸蛋白P0、P1、P2，近年來有大量報(bào)道證實(shí)抗核糖體P蛋白抗體只存在SLE患者中，為SLE特異性抗體，且對SLE診斷特異性很高，是繼抗Sm抗體、抗DNA抗體后發(fā)現(xiàn)的另一SLE特異性抗體。早期僅發(fā)現(xiàn)ARPA在SLE神經(jīng)系統(tǒng)病變中發(fā)揮重要作用，其與嚴(yán)重抑郁、癲癇、癡呆、橫貫性脊髓損傷、無菌性腦膜炎等神經(jīng)

8、精神性狼瘡(NPSLE)臨床癥狀的出現(xiàn)相關(guān)，且滴度與精神病、抑郁的嚴(yán)重程度、臨床病程相關(guān)，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)ARPA與SLE病情活動度、血小板減少及腎臟損害亦相關(guān)，可作為SLE病情活動程度的評價(jià)指標(biāo)。
　　 抗N-甲基-D-天冬氨酸受體抗體（抗NMDA受體抗體），是針對NMDA受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor)的一種抗體。NMDA受體是一種中樞谷氨酸鹽興奮性受體，其在整個(gè)腦神經(jīng)細(xì)胞都有表達(dá)，并對于神經(jīng)

9、突觸形成、神經(jīng)元發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞移行等發(fā)揮重要作用，且影響學(xué)習(xí)和記憶等多種生理過程?？筃MDA受體抗體透過血腦屏障與NMDA受體結(jié)合后，可引起神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常;并可通過與海馬神經(jīng)元的結(jié)合，出現(xiàn)記憶、學(xué)習(xí)等認(rèn)知功能障礙。已有大量研究證實(shí)抗NMDA受體抗體參與NPSLE的發(fā)病機(jī)制，與NPSLE患者情緒低落、短期記憶學(xué)習(xí)能力下降、認(rèn)知功能障礙的臨床表現(xiàn)有關(guān)。
　　 抗神經(jīng)元抗體(Anti-neuronal antib

10、ody, anti-NA)常見為IgG和IgM型，由多種不同抗原成分的抗體組成，大致可分為抗神經(jīng)細(xì)胞膜抗原和抗神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體?？股窠?jīng)元抗體可結(jié)合于神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)分泌細(xì)胞因子，繼而發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)組織損傷。有研究者在有神經(jīng)系統(tǒng)損害的SLE患者血清及腦脊液中發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元抗體，所以推測抗神經(jīng)元抗體可能參與NPSLE發(fā)生機(jī)制中，隨著對抗神經(jīng)元抗體深入研究，沒有發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元核抗體（抗-Hu，抗-Yo，抗-Ri）在NPSLE的發(fā)生

11、機(jī)制發(fā)揮作用，而發(fā)現(xiàn)抗神經(jīng)元抗體（IgG型）與NPSLE的神經(jīng)精神癥狀相關(guān)。
　　 目前對于ACA及ARPA的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，因其操作簡單方便，且可定量檢測抗體水平，故廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中。而抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體（IgG型）目前尚無成熟的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，一些文獻(xiàn)采用體外合成一段肽鏈作為抗原建立間接ELISA法檢測抗NMDA受體抗體，但各研究者使用的陽性對照并不相同，有研究者以預(yù)實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)陽性患

12、者的標(biāo)本作為陽性對照，有研究者利用單克隆抗體作為陽性對照，前者的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性有所降低，而后者應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室中會增加檢測費(fèi)用。對于抗神經(jīng)元抗體的檢測方法有免疫熒光法、免疫放射標(biāo)記法等，大多數(shù)學(xué)者采用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤瘤系細(xì)胞作為抗神經(jīng)元抗體的來源細(xì)胞，免疫熒光法其原理是用熒光抗原標(biāo)記物檢測相應(yīng)抗體，因其免疫熒光非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定客觀性不足，并且技術(shù)程序比較復(fù)雜臨床較少使用，而免疫放射標(biāo)記法也存在不足，其是利用同位素標(biāo)記抗原

13、從而追蹤抗體，故此方法有引起實(shí)驗(yàn)者輻射損傷的可能，并且該實(shí)驗(yàn)易出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)等，也不是臨床實(shí)驗(yàn)室的首選檢測方法。所以對于建立和完善抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體（IgG型）實(shí)驗(yàn)室檢測方法，進(jìn)一步研究其與NPSLE相關(guān)性對于診斷及預(yù)防NPSLE具有重要意義。
　　 目的:
　　 1.完善或建立抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體（IgG型）實(shí)驗(yàn)室檢測方法。
　　 2.研究SLE患者血清中ACA、ARPA、抗

14、NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體等四種自身抗體的表達(dá)水平及其與SLE疾病活動度的關(guān)系，進(jìn)一步評價(jià)四種抗體在SLE尤其是NPSLE臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.建立免疫擴(kuò)散法檢測SLE患者血清中抗Sm抗體，評價(jià)目前臨床常用的免疫印跡法檢測抗Sm抗體的敏感性和特異性。
　　 研究方法:
　　 1、采用夾心ELISA法試劑盒分析30例SLE患者（包括活動期SLE患者組21例和非活動期SLE患者組9例），30例正常人血

15、清及2例NPSLE患者腦脊液中ACA、ARPA兩種抗體的水平。
　　 2、以體外合成的肽抗原(Ac-WEYSvwL-SN-NH2)作為抗原建立間接ELISA法檢測30例SLE患者（包括活動期SLE患者組21例和非活動期SLE患者組9例），30例正常人血清及2例NPSLE患者腦脊液中抗NMDA受體抗體的水平。
　　 3、以人神經(jīng)上皮瘤細(xì)胞株(SK-N-MC)作為抗原建立細(xì)胞-ELISA法檢測30例SLE患者（包括活動期SL

16、E患者組21例和非活動期SLE患者組9例），30例正常人血清及2例NPSLE患者腦脊液中抗神經(jīng)元抗體（IgG型）的水平。
　　 4、以兔胸腺丙酮粉浸出液作為抗原建立免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用免疫印跡法檢測32例SLE患者（包括活動期SLE患者組22例和非活動期SLE患者組10例），30例正常人血清中抗Sm抗體。
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩樣本間的比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn);當(dāng)滿

17、足方差齊性時(shí)，各組均數(shù)間的多重比較使用LSD方法進(jìn)行分析:當(dāng)不滿足方差齊性時(shí)使用近似F檢驗(yàn)(Welch方法)進(jìn)行分析，各組均數(shù)間的多重比較使用校正的多重比較方法(Dunnett'S T3)進(jìn)行分析。完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩樣本率的比較用x2檢驗(yàn)，配對設(shè)計(jì)的兩樣本率的比較用McNemar檢驗(yàn)，非參數(shù)數(shù)據(jù)的相關(guān)分析用Spearman秩相關(guān)，一致性檢驗(yàn)用Kappa檢驗(yàn)。以P＜0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、ACA和

18、ARPA在活動期SLE患者組血清中的表達(dá)水平及陽性率均顯著高于非活動期SLE患者及正常對照組，且ACA、ARPA與SLE病情活動程度呈正相關(guān)，在伴有血小板減少、皮疹、蛋白尿等癥狀的SLE患者中ACA檢出率高，而ARPA僅與SLE患者出現(xiàn)皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān);在SLE患者中同時(shí)檢測ACA和ARPA與單獨(dú)檢測ACA和ARPA對SLE的診斷價(jià)值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體在活動期SLE患者血清中的

19、水平均高于在正常對照組，但活動期SLE患者組與非活動期SLE患者組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，它們與SLE患者血小板減少、皮疹、關(guān)節(jié)炎、蛋白尿臨床表現(xiàn)無關(guān)。
　　 3、2例被診斷為NPSLE的患者血清及腦脊液中ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均陽性，經(jīng)有效治療（1例使用甲基強(qiáng)的松龍1.0g靜脈灌注連續(xù)治療3天，1例使用氨甲喋呤5mg+地塞米松5mg鞘內(nèi)注射治療）癥狀緩解病情穩(wěn)定后，患者血清ARPA仍陽性，但滴度明顯降低，而抗NM

20、DA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均轉(zhuǎn)陰性，相反在腦脊液中三種抗體仍為陽性，但滴度明顯降低。
　　 4、比較免疫擴(kuò)散法與免疫印跡法檢測SLE患者血清中抗Sm抗體的結(jié)果一致性較差(Kappa=0.321)，其兩者陽性率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相比免疫擴(kuò)散法，免疫印跡法檢測抗Sm抗體敏感性更高而特異性較低。
　　 結(jié)論:
　　 1、ACA、ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均可作為SLE診斷的血清學(xué)依據(jù)，且ACA、ARPA

21、與SLE病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可作為判斷SLE治療效果的指標(biāo);
　　 2.ACA與SLE患者出現(xiàn)血小板減少、皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān)，ARPA與SLE患者出現(xiàn)皮疹、蛋白尿臨床表現(xiàn)相關(guān)，抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體與SLE患者血小板減少、皮疹、關(guān)節(jié)炎、蛋白尿臨床表現(xiàn)無關(guān);
　　 3.2例診斷為NPSLE的患者在有效治療前后其腦脊液中ARPA、抗NMDA受體抗體及抗神經(jīng)元抗體均陽性，但治療后滴度明顯下降，而血清中抗NMDA受