人67kDa層粘連蛋白受體(67LR)在粘附介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞系SW480多藥耐藥中的作用及其分子機制.pdf

1、腫瘤多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。國內(nèi)外已在細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中發(fā)現(xiàn)了多種MDR相關(guān)分子并推測相應(yīng)的分子機制，但是并不能完全解釋腫瘤的MDR現(xiàn)象。腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的粘附可以導(dǎo)致耐藥，并將這種形式的耐藥稱為細胞粘附介導(dǎo)的耐藥（celladhesionmediateddrugresistance，CAM-DR）。研究發(fā)現(xiàn)，人67kDa層粘連蛋白受體（human67kDalam

2、ininreceptor，67LR）介導(dǎo)的結(jié)腸癌細胞與細胞外基質(zhì)成分層粘連蛋白（laminin，LN）的粘附與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。本研究旨在研究67LR介導(dǎo)結(jié)腸癌細胞與細胞外基質(zhì)成分LN粘附對于其藥物敏感性的影響，并深入探討67LR作為粘附分子參與結(jié)腸癌CAM-DR的分子機制，將有助于全面理解結(jié)腸癌MDR的發(fā)生和調(diào)節(jié)機制。
　　目的：研究粘附狀態(tài)下結(jié)腸癌細胞SW480對于多種化療藥物的耐受性，并初步探討其耐藥機制；以67

3、LR表達下調(diào)的結(jié)腸癌細胞亞系為模型，在67LR與其特異性配體LN相互識別介導(dǎo)SW480細胞粘附的狀態(tài)下，深入探討67LR的功能及其介導(dǎo)結(jié)腸癌細胞CAM-DR的分子機制，將有助于全面理解結(jié)腸癌MDR的發(fā)生和調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　第一部分：1.通過細胞粘附實驗研究結(jié)腸癌細胞SW480與細胞外基質(zhì)重要組分LN及陰性對照成分牛血清白蛋白（BSA）粘附能力的差別；2.通過MTT比色法檢測粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細胞SW480

4、對于化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）和順鉑（DDP）的藥物敏感性；3.借助流式細胞儀（FCM）檢測粘附于LN以及BSA的SW480細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留，并計算相應(yīng)的藥物泵出率；4.通過AnnexinV/PI染色法檢測粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細胞SW480在化療藥物誘導(dǎo)下的凋亡，并計算相應(yīng)凋亡指數(shù)。
　　第二部分：構(gòu)建67LR的siRNA載體并轉(zhuǎn)染SW480細胞，篩選并建立67LR表達下調(diào)的SW480轉(zhuǎn)染細胞亞系。
　

5、　第三部分：1.通過細胞粘附實驗檢測結(jié)腸癌細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對照細胞與LN以及BSA的粘附能力的差別；2.通過MTT比色法檢測粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對照細胞對于化療藥物5-氟尿嘧啶（5-Fu）和順鉑（DDP）的藥物敏感性；3.通過AnnexinV/PI染色法檢測粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對照細胞在化療藥物誘導(dǎo)下的凋亡

6、，并計算相應(yīng)凋亡指數(shù)；4.通過WesternBlot檢測粘附于LN以及BSA的結(jié)腸癌細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染亞系SW480-si67LR及其對照細胞中凋亡信號途徑相關(guān)蛋白FAK的總蛋白及磷酸化蛋白、Bcl-2和Bax的表達。
　　結(jié)果：
　　第一部分：1.在單位時間內(nèi)，LN組中結(jié)腸癌細胞SW480的粘附細胞數(shù)均明顯高于BSA組（p<0.05）；2.與粘附于BSA的結(jié)腸癌細胞SW480相比，粘附于LN的SW480細胞的化療藥物敏感性顯著下

7、降，對于化療藥物的IC50均相應(yīng)顯著升高，化療藥物誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)明顯減少；細胞內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留均明顯減少，藥物泵出率顯著增加（p<0.05）。
　　第二部分：成功篩選并建立67LR表達下調(diào)的SW480轉(zhuǎn)染細胞亞系。
　　第三部分：1.在單位時間內(nèi)，LN組和BSA組內(nèi)67LR表達水平下調(diào)的
　　結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細胞SW480-si67LR的粘附細胞數(shù)均明顯低于其對照細胞（p<0.05）；2.與LN粘附后，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細胞S

8、W480-si67LR及其對照細胞中均檢測到磷酸化FAK的不同程度的表達，其中SW480-si67LR中磷酸化FAK的表達水平表達明顯下調(diào)，其相對表達率具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；3.與對照成分BSA粘附后，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細胞SW480-si67LR及其對照細胞中均檢測不到磷酸化FAK的不同程度的表達；4.與LN及其對照成分BSA粘附后，SW480-si67LR及其對照細胞中總FAK的表達無統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）；5.在與L

9、N粘附條件下，與其對照細胞相比67LR表達水平下調(diào)的結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染細胞SW480-si67LR的化療藥物敏感性顯著上升，對于化療藥物的IC50相應(yīng)顯著下降，化療藥物誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)明顯增加；細胞內(nèi)Bcl-2的表達顯著降低，Bax表達顯著增強（p<0.05）。
　　結(jié)論：1.與細胞外基質(zhì)成分LN粘附后，結(jié)腸癌細胞可能通過以下兩種途徑增強自身的多藥耐藥性：i.提高腫瘤細胞對藥物轉(zhuǎn)運的能力，導(dǎo)致化療藥物在腫瘤細胞內(nèi)蓄積的減少；ii.提高抗凋亡