青霉素擴(kuò)環(huán)酶的定向改造.pdf

1、第一部分:青霉素擴(kuò)環(huán)酶是實現(xiàn)酶法轉(zhuǎn)化青霉素生產(chǎn)各種半合成頭孢菌素的關(guān)鍵前體7-ADCA的關(guān)鍵酶。獲得對青霉素 G具有高催化能力的擴(kuò)環(huán)酶突變體，是將其引入工業(yè)化生產(chǎn)需要解決的關(guān)鍵問題。本實驗室利用定點突變和靶向突變的方法對來源于棒狀鏈霉菌的青霉素擴(kuò)環(huán)酶進(jìn)行改造，以達(dá)到對青霉素 G的轉(zhuǎn)化活性提高的目的，從而更好的應(yīng)用于7-ADCA的合成。突變位點的選擇是在分析酶與底物青霉素 G復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，先使用RasWin觀察所選擇殘基與底物及

2、附近殘基的相互作用，根據(jù)其性質(zhì)和空間大小選擇可能的突變，然后再使用Swiss PDB Viewer的側(cè)鏈構(gòu)象搜索工具進(jìn)行突變體構(gòu)象的模擬。從底物結(jié)合口袋中選擇了11個位點并設(shè)計了有利的突變傾向，將其中8個組合為4個組合突變庫，另外3個位點采用定點突變研究。我們利用抑菌圈生物活性測定方法以及HPLC檢測青霉素擴(kuò)環(huán)酶對青霉素 G轉(zhuǎn)化率的方法，從中篩選到 Y184A、S261A、S261M、R72T73、V72T73、T72T73六株生物活性

3、提高的突變株。
　　第二部分:來源于產(chǎn)黃頭孢(Acremonium chrysogenum)的擴(kuò)環(huán)/羥化雙功能酶(acDAOC/DACS)可催化底物青霉素 N擴(kuò)環(huán)生成脫乙酰氧基頭孢菌素 C(DAOC)和進(jìn)一步羥化生成脫乙酰頭孢菌素 C(DAC)。對位于底物進(jìn)出口通道處的R308位點氨基酸殘基進(jìn)行飽和突變，從中篩選得到了R308I、R308L、R308T和R308V四種活性得到提高的突變體，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，將 R308突變?yōu)閹в卸痰氖?/p>