大鼠脊髓損傷后EphrinB1表達(dá)及其與Bcl-2-Bax相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是臨床骨科常見(jiàn)的一種致殘性疾病。SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,脊髓損傷引起的細(xì)胞凋亡加重了脊髓的原發(fā)性損傷。SCI后細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在損傷的鄰近部位,通常發(fā)生在損傷8小時(shí)內(nèi);而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡時(shí)間更長(zhǎng),損傷第7天時(shí)白質(zhì)內(nèi)發(fā)生的第二波凋亡。凋亡是一個(gè)復(fù)雜病理生理過(guò)程,受多種凋亡相關(guān)因子調(diào)控。Bcl-2基因家族就是其中之一,主要包括Bcl-2,Bcl-XL,Bc

2、l-xs,Bax,Bad,Bak,Bag,BHRF-1,LMP-1等,其共同特征是在各自的分子上均有BH1和BH2同源結(jié)構(gòu),但它們的作用卻各不相同。Bcl-2是一種具有抗凋亡作用的因子,而B(niǎo)ax為一種具有促凋亡作用的因子,Bcl-2/Bax反映凋亡的趨勢(shì)。軸突導(dǎo)向因子Eph家族是受體酪氨酸激酶家族最大的成員,目前在哺乳動(dòng)物已發(fā)現(xiàn)16個(gè)Eph受體和9個(gè)Ephrin配體。目前的研究發(fā)現(xiàn)Eph參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。Epha3缺失

3、小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后細(xì)胞凋亡降低,而EphrinB3缺失小鼠細(xì)胞凋亡增加;在EphrinB3缺失小鼠側(cè)腦室內(nèi)灌注大量可溶性的EphrinB3-Fc可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖和凋亡,并阻止刨傷性腦損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。Ephrin-A5誘導(dǎo)脊髓腹側(cè)神經(jīng)元凋亡,并參與調(diào)節(jié)脊髓形態(tài)發(fā)生和軸突導(dǎo)向。EphA7反義寡核苷酸抑制大鼠SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)了神經(jīng)傳導(dǎo)功能的恢復(fù)。EphrinB1是第一個(gè)被克隆的EphrinB族成員,最初被認(rèn)為是Eph受體連接蛋白

4、和維甲酸敏感基因,胚胎期廣泛表達(dá),成年期表達(dá)下降。小鼠腦損傷后EphrnB1呈時(shí)空依賴性表達(dá)上調(diào),參與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和軸突再生。背根切斷術(shù)增加了背根神經(jīng)節(jié)中EphrinB1表達(dá),并未引起脊髓組織中EphrinB1升高;組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示EphrinB1主要表達(dá)于中、小背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元,脊髓背側(cè)淺層神經(jīng)元和IB4陽(yáng)性傷害性末端。近年研究發(fā)現(xiàn)EphrinB1-Fe促進(jìn)小鼠胚胎胸腺細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞的凋亡,這種作用與Akt激活和抑制Fas

5、受體引發(fā)的半胱天冬酶蛋白水解有關(guān)。關(guān)于SCI后EphrinB1在膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況及其與凋亡相關(guān)性的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究擬探討大鼠SCI后EphrinB1和凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax表達(dá)特征,并分析EphrinB1與凋亡相關(guān)因子Bcl-2/Bax相關(guān)性,初步證實(shí)EphrinB1參與SCI后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　 第一,根據(jù)Allen氏原理制作大鼠SCI模型,通過(guò)功能學(xué)評(píng)分和組織病理學(xué)檢測(cè)評(píng)估脊髓損傷

6、模型的可靠性。
　　 第二,檢測(cè)大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)EphrinB1的表達(dá)變化特點(diǎn)。
　　 第三,檢測(cè)大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、Bax的表達(dá)變化并分析Bcl-2/Bax值與EphrinB1的表達(dá)變化的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1.60只雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為脊髓損傷3、7、14、28d組,假手術(shù)組和正常組。根據(jù)Allen氏原理制作大鼠脊髓損傷模型。應(yīng)用Rivlin斜板和Tarlov

7、評(píng)分觀察SCI后大鼠神經(jīng)功能情況,通過(guò)HE染色觀察組織的病理學(xué)改變。
　　 2.應(yīng)用免疫組織化學(xué)、免疫熒光方法檢測(cè)大鼠脊髓組織中EphrinB1的表達(dá)及分布情況。利用Real-TimePCR技術(shù)檢測(cè)脊髓組織中EphrinB1mRNA的表達(dá)變化;WesternBlot檢測(cè)脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)EphHnB1蛋白的表達(dá)變化,并利用統(tǒng)計(jì)軟件分析脊髓損傷后EphrinB1mRNA與蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　 3.應(yīng)用免疫熒光方法檢測(cè)

8、大鼠脊髓組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。利用Real-TimePCR檢測(cè)各組脊髓組織中Bcl-2和BaxmRNA的表達(dá)變化:WesternBlot檢測(cè)脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)變化;應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件分析Bcl-2和BaxmRNA與蛋白的相關(guān)性,并分析EphrinB1與Bcl-2/Bax比值的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.Rivlin斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示損傷組傾斜平面臨界角度值較正常組和假手術(shù)組明顯下

9、降(P＜0.05)。Tarlov評(píng)分正常組和假手術(shù)組為6分,損傷3d組小于2分,損傷7d、14d組小于3分,損傷28d組部分評(píng)分超過(guò)3分;損傷組與正常組和假手術(shù)組相比差異顯著(P＜0.05)。HE染色結(jié)果顯示,正常組和假手術(shù)組脊髓的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整;損傷脊髓出現(xiàn)灶性出血、腫脹。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡,結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,空泡形成,膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　 2.免疫組化結(jié)果顯示EphrinB1在正常組和假手術(shù)組脊髓組織可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)。損傷組可見(jiàn)

10、大量EphrinB1陽(yáng)性細(xì)胞,傷后14d脊髓組織的EphrinB1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較其他損傷組顯著增多(P＜0.05)。免疫熒光結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脊髓組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)EphrinB1,星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增生,EphrinB1和GFAP熒光強(qiáng)度在損傷脊髓顯著增強(qiáng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示傷后14d組熒光強(qiáng)度達(dá)到高峰。WesternBlot和Real-TimePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EphdnB1蛋白和mRNA在正常組和假手術(shù)組就有表達(dá);傷后3d開(kāi)始升高,7d顯著升高,

11、14d時(shí)達(dá)到高峰,28天時(shí)降低,但其表達(dá)水平較正常組和假手術(shù)組有顯著性差異(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示EphrinB1蛋白與mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　 3.免疫熒光方法檢測(cè)結(jié)果顯示Bcl-2和Bax在正常組和假手術(shù)組脊髓組織可見(jiàn)少量熒光。損傷脊髓組織中Bcl-2、Bax和GFAP熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),高峰分別出現(xiàn)在傷后14d和7d。Real-TimePCR和WesternBlot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bax蛋白和mRNA在脊

12、髓損傷后升高,Bcl-2的表達(dá)高峰為傷后第14d,Bax表達(dá)高峰出現(xiàn)在傷后第7d,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示Bcl-2和Bax蛋白與mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān),EphrinBl表達(dá)與Bcl-2/Bax值呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實(shí)驗(yàn)制作的大鼠脊髓損傷模型所需設(shè)備簡(jiǎn)單,操作簡(jiǎn)便易行,重復(fù)性較好,基本滿足SCI模型制作標(biāo)準(zhǔn)。
　　 2.大鼠脊髓損傷后EphrinBl蛋白表達(dá)升高,星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)EphrinB1Eph