大鼠脊髓損傷后EphrinB1表達及其與Bcl-2-Bax相關性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是臨床骨科常見的一種致殘性疾病。SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,脊髓損傷引起的細胞凋亡加重了脊髓的原發(fā)性損傷。SCI后細胞凋亡主要發(fā)生在損傷的鄰近部位,通常發(fā)生在損傷8小時內;而神經膠質細胞的凋亡時間更長,損傷第7天時白質內發(fā)生的第二波凋亡。凋亡是一個復雜病理生理過程,受多種凋亡相關因子調控。Bcl-2基因家族就是其中之一,主要包括Bcl-2,Bcl-XL,Bc

2、l-xs,Bax,Bad,Bak,Bag,BHRF-1,LMP-1等,其共同特征是在各自的分子上均有BH1和BH2同源結構,但它們的作用卻各不相同。Bcl-2是一種具有抗凋亡作用的因子,而Bax為一種具有促凋亡作用的因子,Bcl-2/Bax反映凋亡的趨勢。軸突導向因子Eph家族是受體酪氨酸激酶家族最大的成員,目前在哺乳動物已發(fā)現(xiàn)16個Eph受體和9個Ephrin配體。目前的研究發(fā)現(xiàn)Eph參與中樞神經系統(tǒng)損傷后細胞凋亡調節(jié)。Epha3缺失

3、小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后細胞凋亡降低,而EphrinB3缺失小鼠細胞凋亡增加;在EphrinB3缺失小鼠側腦室內灌注大量可溶性的EphrinB3-Fc可逆轉細胞增殖和凋亡,并阻止刨傷性腦損傷誘導的細胞增殖。Ephrin-A5誘導脊髓腹側神經元凋亡,并參與調節(jié)脊髓形態(tài)發(fā)生和軸突導向。EphA7反義寡核苷酸抑制大鼠SCI后神經細胞凋亡,并促進了神經傳導功能的恢復。EphrinB1是第一個被克隆的EphrinB族成員,最初被認為是Eph受體連接蛋白

4、和維甲酸敏感基因,胚胎期廣泛表達,成年期表達下降。小鼠腦損傷后EphrnB1呈時空依賴性表達上調,參與星形膠質細胞活化和軸突再生。背根切斷術增加了背根神經節(jié)中EphrinB1表達,并未引起脊髓組織中EphrinB1升高;組織學檢測結果顯示EphrinB1主要表達于中、小背根神經節(jié)的神經元,脊髓背側淺層神經元和IB4陽性傷害性末端。近年研究發(fā)現(xiàn)EphrinB1-Fe促進小鼠胚胎胸腺細胞凋亡和淋巴細胞的凋亡,這種作用與Akt激活和抑制Fas

5、受體引發(fā)的半胱天冬酶蛋白水解有關。關于SCI后EphrinB1在膠質細胞的表達情況及其與凋亡相關性的研究目前尚未見報道。
　　 本研究擬探討大鼠SCI后EphrinB1和凋亡相關因子Bcl-2、Bax表達特征,并分析EphrinB1與凋亡相關因子Bcl-2/Bax相關性,初步證實EphrinB1參與SCI后神經細胞凋亡的調節(jié)。
　　 第一,根據(jù)Allen氏原理制作大鼠SCI模型,通過功能學評分和組織病理學檢測評估脊髓損傷

6、模型的可靠性。
　　 第二,檢測大鼠脊髓損傷后不同時間點EphrinB1的表達變化特點。
　　 第三,檢測大鼠脊髓損傷后不同時間點Bcl-2、Bax的表達變化并分析Bcl-2/Bax值與EphrinB1的表達變化的相關性。
　　 方法：
　　 1.60只雌性Wistar大鼠隨機分為脊髓損傷3、7、14、28d組,假手術組和正常組。根據(jù)Allen氏原理制作大鼠脊髓損傷模型。應用Rivlin斜板和Tarlov

7、評分觀察SCI后大鼠神經功能情況,通過HE染色觀察組織的病理學改變。
　　 2.應用免疫組織化學、免疫熒光方法檢測大鼠脊髓組織中EphrinB1的表達及分布情況。利用Real-TimePCR技術檢測脊髓組織中EphrinB1mRNA的表達變化;WesternBlot檢測脊髓損傷后不同時間點EphHnB1蛋白的表達變化,并利用統(tǒng)計軟件分析脊髓損傷后EphrinB1mRNA與蛋白表達的相關性。
　　 3.應用免疫熒光方法檢測

8、大鼠脊髓組織中Bcl-2和Bax的表達情況。利用Real-TimePCR檢測各組脊髓組織中Bcl-2和BaxmRNA的表達變化:WesternBlot檢測脊髓損傷后不同時間點Bcl-2和Bax蛋白的表達變化;應用統(tǒng)計軟件分析Bcl-2和BaxmRNA與蛋白的相關性,并分析EphrinB1與Bcl-2/Bax比值的相關性。
　　 結果：
　　 1.Rivlin斜板實驗結果顯示損傷組傾斜平面臨界角度值較正常組和假手術組明顯下

9、降(P＜0.05)。Tarlov評分正常組和假手術組為6分,損傷3d組小于2分,損傷7d、14d組小于3分,損傷28d組部分評分超過3分;損傷組與正常組和假手術組相比差異顯著(P＜0.05)。HE染色結果顯示,正常組和假手術組脊髓的形態(tài)結構完整;損傷脊髓出現(xiàn)灶性出血、腫脹。神經元和膠質細胞凋亡,結構破壞嚴重,空泡形成,膠質細胞增生。
　　 2.免疫組化結果顯示EphrinB1在正常組和假手術組脊髓組織可見少量陽性表達。損傷組可見

10、大量EphrinB1陽性細胞,傷后14d脊髓組織的EphrinB1陽性細胞數(shù)較其他損傷組顯著增多(P＜0.05)。免疫熒光結果檢測發(fā)現(xiàn)脊髓組織的星形膠質細胞表達EphrinB1,星形膠質細胞顯著增生,EphrinB1和GFAP熒光強度在損傷脊髓顯著增強,統(tǒng)計結果顯示傷后14d組熒光強度達到高峰。WesternBlot和Real-TimePCR檢測發(fā)現(xiàn)EphdnB1蛋白和mRNA在正常組和假手術組就有表達;傷后3d開始升高,7d顯著升高,

11、14d時達到高峰,28天時降低,但其表達水平較正常組和假手術組有顯著性差異(P＜0.05)。統(tǒng)計分析結果顯示EphrinB1蛋白與mRNA的表達呈正相關。
　　 3.免疫熒光方法檢測結果顯示Bcl-2和Bax在正常組和假手術組脊髓組織可見少量熒光。損傷脊髓組織中Bcl-2、Bax和GFAP熒光強度顯著增強,高峰分別出現(xiàn)在傷后14d和7d。Real-TimePCR和WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2和Bax蛋白和mRNA在脊

12、髓損傷后升高,Bcl-2的表達高峰為傷后第14d,Bax表達高峰出現(xiàn)在傷后第7d,統(tǒng)計分析結果顯示Bcl-2和Bax蛋白與mRNA表達呈顯著正相關,EphrinBl表達與Bcl-2/Bax值呈正相關。
　　 結論：
　　 1.本實驗制作的大鼠脊髓損傷模型所需設備簡單,操作簡便易行,重復性較好,基本滿足SCI模型制作標準。
　　 2.大鼠脊髓損傷后EphrinBl蛋白表達升高,星形膠質細胞表達EphrinB1Eph